水生棲熱菌FL-03海藻糖合酶基因的克隆及真核表達(dá)

劉俊梅，聶海彥，鄭微微，胡耀輝*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

水生棲熱菌FL-03海藻糖合酶基因的克隆及真核表達(dá)

劉俊梅，聶海彥，鄭微微，胡耀輝*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

通過基因工程技術(shù)合成海藻糖合酶Tres全基因，插入到畢赤酵母菌表達(dá)載體pPICZα中。電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115后，經(jīng)Zeocin抗性篩選陽性菌株。用PCR和全基因測序鑒定目的基因的表達(dá)。通過誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并以SDS-PAGE和Western blotting進(jìn)行鑒定。成功地構(gòu)建了pPICZα-Tres重組質(zhì)粒，并證明目的基因已整合于畢赤酵母菌的基因組。

海藻糖合酶；Tres全基因；基因克隆；真核表達(dá)

海藻糖(Trehalose，α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside) 是一種由兩個葡萄糖分子以α-α糖苷鍵結(jié)合的非還原性雙糖，它的分子式是C12H22O11·2H2O，相對分子質(zhì)量為378.33，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、藻類中均發(fā)現(xiàn)有海藻糖存在。當(dāng)細(xì)胞處于饑餓、干燥、高滲透壓、脫水等脅迫環(huán)境時，海藻糖能有效地保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶的生物活性，從而提高這些生物的抗逆性，對這一現(xiàn)象的深層次研究表明，海藻糖可以對生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)揮保護(hù)作用，從而使富含這種奇妙化合物的生命體對外界的惡劣環(huán)境表現(xiàn)出獨特的生物學(xué)特性[1]。同時海藻糖安全無公害，它作為一種綠色食品添加劑已陸續(xù)通過美國和歐盟的認(rèn)證。

而從水生棲熱菌中分離得到的海藻糖合酶具有熱穩(wěn)定性好，最適作用溫度高(60℃)的特點，所以在工業(yè)化生產(chǎn)過程中可以避免雜菌污染。同時，因為從底物到產(chǎn)物只經(jīng)過一次酶的催化，反應(yīng)簡單，并且底物價格低廉，因此，該酶適合于應(yīng)用到海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)中[2]。但是，水生棲熱菌中海藻糖合酶酶活力低，且分離過程比較復(fù)雜，成本很高。因此將水生棲熱菌Tres基因進(jìn)行克隆并將其在畢赤酵母中表達(dá)，構(gòu)建出高產(chǎn)海藻糖合酶基因的工程菌株，從而簡化海藻糖合酶的生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步降低海藻糖的生產(chǎn)成本，為海藻糖合成酶在海藻糖的規(guī)?；⒐I(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ、T4DNA連接酶 大連寶生物工程公司；DNA凝膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒 TaKaRa公司；瓊脂糖、焦磷酸二乙酯(DEPC) Promega公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與裂解緩沖液

LB低鹽液體培養(yǎng)基：在950mL去離子水中加入：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 5g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L NaOH調(diào)pH7.0，用去離子水定容至1L，在0.1034MPa高壓下蒸汽滅菌20min。YEPD復(fù)合培養(yǎng)基：酵母提取物10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加水至1000mL。畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基(BMMY)由上海杰美基因藥科技有限公司提供。

裂解緩沖液：20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10mmol/L EDTA(pH 8.0)、5.0g/L Triton X-100。

1.1.4 引物

依據(jù)GeneBank發(fā)表的海藻糖合酶序列(登錄號：D86216)和真核表達(dá)載體pPICZα的多克隆位點設(shè)計引物，上游引物：5＇-CCGCTCGAGAAAAGAATGGA CCCCCTCTGGTACAAGGA-3＇(下劃線為XhoⅠ酶切位點)；下游引物：5＇-GCTCTAGACTAGGCTTTTC CGGCCTTGGCCT-3＇(下劃線為XbaⅠ酶切位點)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增目的基因Tres

以水生棲熱菌FL-03基因組DNA為模板，采用高保真Prime STARTMHS 聚合酶擴(kuò)增目的片段。第一輪PCR擴(kuò)增條件為： 94℃ 5min；94℃ 30s； 55℃ 45s；72℃ 3min；30個循環(huán)后72℃延伸10min；第二輪PCR擴(kuò)增條件為： 94℃ 5min；94℃ 30s； 55℃ 45s；72℃3min；35個循環(huán)后72℃延伸30min，瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收P C R產(chǎn)物。A T連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α，篩選到的陽性克隆測序正確后，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-simple-Tres。

1.2.2 構(gòu)建海藻糖合酶真核表達(dá)載體

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-simple-Tres和表達(dá)載體pPICZα，回收目的基因片段。將回收的目的基因片段和表達(dá)載體pPICZα用T 4 D N A連接酶于1 6℃連接1 6 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α，篩選到的陽性克隆測序正確后，獲得載體pPICZα-Tres，其中陽性克隆的篩選標(biāo)記抗生素為Zeocin。

1.2.3 畢赤酵母電轉(zhuǎn)化及重組菌的篩選鑒定

按照Invitrogen公司提供的畢赤酵母操作手冊制備畢赤酵母Gs115感受態(tài)細(xì)胞[3]。將表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-Tres電擊轉(zhuǎn)化到感受態(tài)Gs115酵母菌中，電擊結(jié)束，取200μL轉(zhuǎn)化液涂布于含抗生素Zecion(100μg/mL)的YPDS平板上，于28～30℃溫箱中培養(yǎng)2～3d。挑取單個菌落接種于5mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于28～30℃、250～300r/min振蕩培養(yǎng)2～3d。離心回收菌體，提取酵母菌基因組DNA作PCR鑒定。

1.2.4 海藻糖合酶基因融和蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

選取鑒定正確的工程菌置于BMGY培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心棄上清，菌體重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中使OD600nm為1～1.5 ，每24h補(bǔ)加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)72h，每24h取1mL菌液，5000r/min離心5min，收集菌體沉淀。向菌體沉淀中加入裂解緩沖液100μL和等體積的玻璃珠，劇烈振蕩1min，冰浴1min，重復(fù)15次，4℃、12000r/min高速離心收集上清液，上清液進(jìn)行12%分離膠的SDS-PAGE電泳。對上述粗酶液分別進(jìn)行蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳以檢測表達(dá)情況，同時以沒進(jìn)行誘導(dǎo)的菌液作為陰性對照。蛋白樣品上樣前先加入等體積的2×SDS-PAGE樣品處理液在沸水浴中煮5min，10000×g離心3min后取上清液上樣。采用恒壓200V，電泳45min左右結(jié)束。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.5 海藻糖合酶Western blotting分析[3]

陽性菌株表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，用封閉液室溫封閉2h，PBS洗膜3次，在加入以1: 1000稀釋的鼠抗6×His單克隆抗體室溫反應(yīng)過夜，同上洗膜，再以相應(yīng)的1:500

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

水生嗜熱菌FL-03(Thermus aquaticus)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoria)、大腸桿菌 DH5α及表達(dá)載體pPICZα均為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)功能性食品和生化實驗室保存；克隆載體pMD18-T-simple購自TaKaRa公司。稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，再次洗膜，最后經(jīng)3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)底物顯色液顯色分析。

圖1 pPICZα表達(dá)載體Fig.1 Map of pPICZαA expression vector

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取及其擴(kuò)增

獲得水生棲熱菌FL-03染色體基因組DNA，并以其為模板，PCR擴(kuò)增出約2.9kb的特異性片段(圖2)，大小與理論預(yù)測相符。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將擴(kuò)增得到的目的基因純化后，進(jìn)行TA克隆，隨機(jī)挑取單個白色菌落，接種于LB培養(yǎng)基中(含Amp 100 μg/mL)，37℃振蕩培養(yǎng)12h。收集菌體，提取重組質(zhì)粒，用XbaI、XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定(圖3)。同時重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR(圖4)，進(jìn)一步測序顯示，插入表達(dá)載體的基因片段與GeneBank 發(fā)表的海藻糖合酶序列(登錄號：D86216.1)同源性達(dá)99%，編碼氨基酸序列完全一致。

圖3 重組質(zhì)粒pMD18-T-simple-Tres和pPICZα-Tres的酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion based identification of recombinant plasmids pMD18-T-simple-Tres and pPICZα-Tres

圖 4 pMD18-T-simple-Tres和 pPICZα-Tres的 PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant plasmids pMD18-T-simple-Tres and pPICZα-Tres

2.3 海藻糖合成酶的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blotting鑒定

重組有Tres基因的酵母菌株Gs115誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAG可檢測到一個大小約110kD的蛋白質(zhì)，這與Tres的相對分子質(zhì)量大小相符，作為對照，整合有空質(zhì)粒的酵母細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)后，未檢測到相應(yīng)大小的條帶(圖 5)。

圖5 不同時間誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expressed protein at different time points of induction

圖6 表達(dá)海藻糖合酶的Western blotting分析Fig.6 Western blotting analysis of expressed trehalose synthase

利用抗鼠6×His單克隆抗體對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行West-ern blotting鑒定，發(fā)生特異反應(yīng)的蛋白帶與SDS-PAGE中特異表達(dá)帶相一致(圖6)，從而證明Tres基因與表達(dá)載體實現(xiàn)了α-factor標(biāo)簽在酵母菌株Gs115中的融合表達(dá)。

3 討 論

目前來源于Thermobifidafusca、Thermus aquaticusATCC 33923、Picrophiustorridus、Pseudomonas stutzeri、Mycobacterium smegmatisATCC14468、ThermuscaldophilusGK24等的海藻糖合酶基因均已在大腸桿菌中實現(xiàn)表達(dá)[4-5]，但由于原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量低、純化困難，對真核蛋白不能進(jìn)行翻譯后加工和修飾，尤其是難以除盡內(nèi)毒素原，因此本研究采用新型外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)——巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)[6]。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種單細(xì)胞真核生物，其基因工程菌近年來已被廣泛用于商業(yè)化生產(chǎn)各種外源蛋白。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來公認(rèn)的最有效的新型外源蛋白真核基因表達(dá)系統(tǒng)之一，已有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)[7-8]，潛力巨大。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白除了具有真核系統(tǒng)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾[9](信號肽的剪切、糖基化修飾、蛋白折疊)等特點，還具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌、高密度發(fā)酵、容易大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，因此該表達(dá)系統(tǒng)對于新型酶種的開發(fā)具有重大意義。

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Cloning and Eukaryotic Expression of Trehalose Synthase Gene fromThermus aquaticusFL-03

LIU Jun-mei，NIE Hai-yan，ZHENG Wei-wei，HU Yao-hui*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The full-length trehalose synthase gene (Tres) was synthesized by genetic engineering and inserted into thePichiaexpression vector pPICZα. The expression vector carryingTresgene was transformed into the competent cells ofPichiaGS115 by means of electroporation, and Zeocin resistance screening was then performed to find positive strains. PCR and gene sequencing were used to identify the expression of the target gene. The expressed protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The results suggested that the recombinant plamid pPICZα-Treswas successfully constructed and that the target gene had been integrated into thePichiagenome.

trehalose synthase；Tresgene；gene cloning；eukaryotic expression

TQ925.1

A

1002-6630(2010)23-0267-04

2010-09-14

國家科技部成果轉(zhuǎn)化基金項目(2007GB2B10072 )；分子酶工程教育部重點實驗室平臺基地建設(shè)項目(20100419)

劉俊梅(1973—)，女，講師，博士研究生，研究方向為功能性食品與生物反應(yīng)器。E-mail：spring430817@163.com

*通信作者：胡耀輝(1951—)，男，教授，學(xué)士，研究方向為功能性食品與生物反應(yīng)器。E-mail：huyaohui@163.vip.com