劉勝男，張　燕，劉泰瑜，許　可，張建國(guó)

(上海理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093)

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TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母突變株

劉勝男，張燕，劉泰瑜，許可，張建國(guó)

(上海理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093)

采用TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株，探討了pH值、菌體濃度(OD600)、反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞存活率等對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響，并與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在pH值為4.0～7.0或菌體濃度(OD600)低于50.00時(shí)，pH值、OD600均與1,3,5-三苯基甲臜(TPF)生成量(OD485)呈線性正相關(guān)關(guān)系；反應(yīng)時(shí)間超過(guò)9 h后可以保持穩(wěn)定的TPF生成量；死細(xì)胞對(duì)TTC顯色反應(yīng)無(wú)干擾，在細(xì)胞存活率低于50%時(shí)，仍然可以采用TTC比色法測(cè)定細(xì)胞活性。表明，TTC比色法在一定范圍內(nèi)可以篩選高存活率畢赤酵母突變株，且操作簡(jiǎn)單省時(shí)，為篩選高存活率的微生物菌株提供了可靠技術(shù)。

TTC比色法；畢赤酵母；存活率；優(yōu)化；亞硝基胍；篩選

畢赤酵母是一種重要的工業(yè)微生物，以畢赤酵母為對(duì)象研究工業(yè)微生物中的共性問(wèn)題具有重要的示范意義。畢赤酵母是具有良好應(yīng)用前景的細(xì)胞工廠，尤其是在高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)方面受到研究者的重視[1]，目前已報(bào)道有600多種外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母中成功表達(dá)，畢赤酵母表達(dá)的外源蛋白在食品工業(yè)的應(yīng)用潛力巨大[2]。畢赤酵母的優(yōu)點(diǎn)是：基因操作和培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單、成熟，可以分泌表達(dá)不同來(lái)源的基因[3]，有與人相近的蛋白質(zhì)糖基化系統(tǒng)[4]，高密度發(fā)酵(130g·L-1)。

目前，畢赤酵母高密度發(fā)酵的主要方式是控制溶氧和流加碳源的濃度：(1)控制溶氧濃度在20%以上可以保證畢赤酵母具有一定的代謝甲醇的能力[5]，但受甲醇濃度、攪拌、通氣等因素的影響，控制穩(wěn)定的溶氧濃度較困難[6]，若溶氧濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]；另外，以傳感器測(cè)定甲醇濃度[8]、建立生長(zhǎng)模型[9]、調(diào)整進(jìn)氣口的氧分壓[6]等方式控制溶氧濃度會(huì)使發(fā)酵液變?yōu)榉桥ｎD流體而干擾溶氧的測(cè)定[7]，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程失敗。(2)控制流加碳源(甲醇)濃度。在MutS型畢赤酵母的誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇濃度一般控制在0.2%～0.8%[10]，Mut+型畢赤酵母的誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇濃度一般控制在3%[11]。

由于畢赤酵母以甲醇為碳源的比生長(zhǎng)速率較低(0.002～0.14h-1)，從而限制了外源蛋白的表達(dá)[12]，細(xì)胞死亡率達(dá)到35%[13]， 提高微生物細(xì)胞存活率因此成為近年來(lái)的研究重點(diǎn)[14]。不同學(xué)者報(bào)道的畢赤酵母高密度發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞存活率有所不同。Xiao等[15]在培養(yǎng)畢赤酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)畢赤酵母的細(xì)胞存活率在74%～91%之間；Hohenblum等[13]以批式流加方式培養(yǎng)畢赤酵母時(shí)，畢赤酵母的細(xì)胞存活率低于70%；Routledge等[16]搖瓶培養(yǎng)畢赤酵母時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到100%，這可能與分批培養(yǎng)畢赤酵母的培養(yǎng)時(shí)間較短有關(guān)。

目前，提高細(xì)胞存活率的方法有很多，如利用轉(zhuǎn)錄因子提高細(xì)胞適應(yīng)耐受環(huán)境的壓力、利用TATA結(jié)合蛋白和σ70提高釀酒酵母耐受酒精的能力[17]、利用產(chǎn)物泄露的方式降低產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性、動(dòng)態(tài)控制蛋白質(zhì)的表達(dá)和平衡細(xì)胞中的代謝過(guò)程，但這些方法都需要復(fù)雜的技術(shù)[17]。而亞硝基胍(NTG)誘變方法較為成熟，操作簡(jiǎn)單[18]，是提高細(xì)胞存活率的有效途徑。采用人工細(xì)胞計(jì)數(shù)篩選高存活率突變株工作量大、誤差大，因此，需要尋找一種簡(jiǎn)單的篩選方法?；?,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)可利用細(xì)胞呼吸鏈中的脫氫酶還原為紅色的1,3,5-三苯基甲臜(TPF)[19]，可用TTC比色法篩選[20]。為此，作者采用TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母NTG突變株，探討了pH值、菌體濃度、反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞存活率等對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響，并與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行了比較。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1菌種與培養(yǎng)基

畢赤酵母GS115，購(gòu)于生命科學(xué)公司(Waltham,MA,USA)。

YPD培養(yǎng)基：酵母粉 10g·L-1，蛋白胨 20g·L-1，葡萄糖 20g·L-1，瓊脂粉15g·L-1(平板培養(yǎng)時(shí)添加)。

BMGY培養(yǎng)基: 酵母粉 10g·L-1，蛋白胨 20g·L-1，磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)100mmol·L-1，甘油 20g·L-1，硫酸銨 20g·L-1，生物素4×10-4g·L-1。

1.2畢赤酵母的培養(yǎng)

將25% 甘油保存的畢赤酵母轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3d；然后轉(zhuǎn)接到含有25mLYPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30 ℃、200r·min-1培養(yǎng)18～20h；再以4%接種量轉(zhuǎn)接到含有25mLBMGY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30 ℃、200r·min-1培養(yǎng)2d后每24h加入1.0%甲醇誘導(dǎo)3d。

1.3畢赤酵母的NTG誘變

參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行NTG誘變：10mL畢赤酵母經(jīng)BMGY培養(yǎng)2d后的菌體濃度(OD600)約為30.00；用100mmol·L-1檸檬酸緩沖液(pH值5.5)洗滌2次后，重懸于10mL100mmol·L-1檸檬酸緩沖液中；加入NTG使終濃度為500μg·mL-1，誘變30min，得到致死率約為88%的畢赤酵母細(xì)胞。

1.4TTC顯色反應(yīng)條件探討

1.4.1pH值對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響

取1.0 mL菌液，10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL含0.4%TTC的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的100 mmol·L-1Tris緩沖液，振蕩混勻，置于搖床上12 h；10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL的85%二甲基亞砜，振蕩混勻；10 000 r·min-1離心1 min，取上清液測(cè)OD485。

1.4.2菌體濃度對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響

分別取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL菌液(菌體濃度在5.71～57.12之間)，10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL含0.4%TTC的pH值為8.0的100 mmol·L-1Tris緩沖液，振蕩混勻，置于搖床上12 h；10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL的85%二甲基亞砜，振蕩混勻；10 000 r·min-1離心1 min，取上清液測(cè)OD485。

1.4.3反應(yīng)時(shí)間對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響

取1.0 mL菌液于2.0 mL離心管中，10 000 r·min-1離心1 min，去上清，加入1.0 mL含0.4%TTC的pH值為8.0的100 mmol·L-1Tris緩沖液，振蕩混勻，置于搖床上12 h，期間每隔1 h對(duì)菌液進(jìn)行10 000 r·min-1離心，去上清，加入1.0 mL的85%二甲基亞砜后振蕩混勻；10 000 r·min-1離心1 min，取上清液測(cè)OD485。

1.4.4細(xì)胞存活率對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響

將畢赤酵母活細(xì)胞和高溫滅活的酵母死細(xì)胞混合，得到不同存活率的菌液，畢赤酵母細(xì)胞的終體積為2.0 mL。按上述方法進(jìn)行TTC顯色反應(yīng)，測(cè)OD485。

1.5TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株

首先測(cè)定NTG誘變后畢赤酵母菌株的TTC顯色反應(yīng)的吸光度(OD485)，再利用OD485值和活細(xì)胞數(shù)目之間的關(guān)系計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目，最后計(jì)算畢赤酵母細(xì)胞的存活率。

2　結(jié)果與討論

2.1pH值對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響(圖1)

圖1　pH值對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響Fig.1　Effect of pH value on TTC colorimetric reaction

由圖1可以看出，畢赤酵母生長(zhǎng)的pH值范圍為4.0～8.0，在此范圍內(nèi)，TPF的生成量(OD485)隨著pH值的升高而升高；其中，在pH值為4.0～7.0范圍內(nèi)pH值與OD485呈線性正相關(guān)關(guān)系(OD485=0.1007×pH值-0.3019，R2=0.9922)。表明，低pH值條件下畢赤酵母細(xì)胞的呼吸活性較低，升高pH值有利于提高畢赤酵母細(xì)胞的呼吸活性。由圖1還可以看出，在畢赤酵母可以生長(zhǎng)的pH值范圍內(nèi)都可以用TTC顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)定細(xì)胞活性。

2.2菌體濃度對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響(圖2)

由圖2可以看出，pH值8.0條件下，OD485隨著畢赤酵母菌體濃度(OD600)的升高(從5.71升高到57.12)而升高，且OD485與OD600呈線性正相關(guān)關(guān)系(OD485=0.0089×OD600+0.0615，R2=0.9264)。表明，菌體濃度(OD600)在5.71～57.12范圍內(nèi)都可以用TTC顯色反應(yīng)測(cè)定畢赤酵母細(xì)胞活性。由于畢赤酵母在搖瓶中培養(yǎng)的菌體濃度(OD600)最高為50.00[22]，所以采用TTC比色法可以不稀釋菌體濃度直接測(cè)定畢赤酵母細(xì)胞活性，簡(jiǎn)化了操作步驟。

圖2　菌體濃度對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響Fig.2　Effect of OD600 value on TTC colorimetric reaction

2.3反應(yīng)時(shí)間對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響(圖3)

圖3　反應(yīng)時(shí)間對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響Fig.3　Effect of reaction time on TTC colorimetric reaction

由圖3可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD485不斷升高；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)9 h后，OD485保持不變。表明，反應(yīng)時(shí)間超過(guò)9 h可以保持穩(wěn)定的TPF生成量，也可以避免后續(xù)操作中反應(yīng)時(shí)間對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響。

2.4細(xì)胞存活率對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響(圖4)

圖4　細(xì)胞存活率對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響Fig.4　Effect of cell viability on TTC colorimetric reaction

由圖4可以看出，在細(xì)胞存活率小于50%的情況下，隨著細(xì)胞存活率的升高，OD485逐漸升高，且OD485與細(xì)胞存活率呈線性正相關(guān)關(guān)系(OD485=0.0127×細(xì)胞存活率-0.0483，R2=0.9589)。表明采用TTC比色法可以在細(xì)胞存活率低于50%的條件下測(cè)定畢赤酵母細(xì)胞活性，說(shuō)明死細(xì)胞對(duì)TTC比色法的干擾不明顯。

2.5TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株

隨機(jī)選取20株NTG誘變的畢赤酵母菌株，用TTC比色法測(cè)定OD485/OD600值(表征細(xì)胞存活率)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，OD485/OD600值的最低值為37.82，最高值為69.13。

將OD485/OD600值最高的14#突變株培養(yǎng)后分別畢赤酵母的OD485/OD600值采用TTC比色法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞存活率，并與畢赤酵母GS115進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5TTC比色法測(cè)定NTG誘變后的

Fig.5OD485/OD600value ofPichiapastorismutated by NTGviaTTC colorimetric method

圖6　TTC比色法(a)與平板計(jì)數(shù)法(b)測(cè)定的畢赤酵母細(xì)胞存活率Fig.6　Cell viability of Pichia pastoris via TTC colorimetric method(a) and plate counting method(b)

由圖6可以看出，采用TTC比色法測(cè)得GS115菌株和14#NTG誘變菌株的OD485/OD600值分別為53.00、58.23；采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)得GS115菌株和14#NTG誘變菌株的存活率分別為48.10%、61.68%。表明TTC比色法能準(zhǔn)確描述畢赤酵母細(xì)胞的存活率。

2.6討論

誘變和篩選具有耐受環(huán)境或者特殊形狀的工業(yè)微生物是目前的研究熱點(diǎn)。誘變法分為化學(xué)法、物理法、空間技術(shù)、基因工程等。通過(guò)各種誘變手段改變菌體的遺傳性狀后，從數(shù)量龐大的突變菌種庫(kù)中篩選目標(biāo)菌種是最關(guān)鍵的步驟，決定能否得到目的突變株，也決定了誘變效率。由于微生物種類(lèi)和誘變篩選的目的形狀的多樣性，篩選方法也有所不同，主要有抗性篩選、熒光標(biāo)記篩選、PCR技術(shù)篩選。對(duì)篩選菌株活性的測(cè)定大多采用稀釋涂平板法，該方法非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究以TTC比色法代替稀釋涂平板法，簡(jiǎn)單省時(shí)；利用酶標(biāo)儀可以同時(shí)測(cè)定近百個(gè)樣品，提高了測(cè)定效率，但TTC比色法仍需要對(duì)每一個(gè)菌株進(jìn)行測(cè)定，這也是需要進(jìn)一步改進(jìn)的地方。

3　結(jié)論

采用TTC比色法篩選高存活率畢赤酵母NTG突變株，探討了pH值、菌體濃度(OD600)、反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞存活率等對(duì)TTC顯色反應(yīng)的影響，并與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在pH值為4.0～7.0、菌體濃度(OD600)低于50.00時(shí)，pH值、OD600均與1,3,5-三苯基甲臜(TPF)生成量(OD485)呈線性正相關(guān)關(guān)系；反應(yīng)時(shí)間超過(guò)9 h后可以保持穩(wěn)定的TPF生成量；死細(xì)胞對(duì)TTC顯色反應(yīng)無(wú)干擾，在細(xì)胞存活率低于50%時(shí)，仍然可以采用TTC比色法測(cè)定細(xì)胞活性。表明，TTC比色法在一定范圍內(nèi)可以篩選高存活率畢赤酵母突變株，且操作簡(jiǎn)單省時(shí)，為篩選高存活率的微生物菌株提供了可靠技術(shù)。

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Screening of High Cell ViabilityPichiapastorisMutant by TTC Colorimetric Method

LIU Sheng-nan,ZHANG Yan,LIU Tai-yu,XU Ke,ZHANG Jian-guo

(InstituteofFoodScienceandEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

HighcellviabilityPichia pastorismutantwasscreenedbyTTCcolorimetricmethod.TheeffectsofpHvalue,celldensity(OD600),reactiontime,cellviabilityonTTCcolorimetricreactionwereinvestigated,andcomparedwiththeplatecountingmethod.ResultsindicatedthatOD485of1,3,5-triphenylformazan(TPF)wasproportionalrelatedtothepHvalue(4.0～7.0)orOD600(below50.00).AndtheproductionofTPFremainedstableafterreactionfor9h.Deadcellsdidnotinterferewithcolorimetricreaction.SoTTCcolorimetricmethodcouldbeusedtodetectcellactivityevenwhenthecellviabilitywasbellow50%.TTCcolorimetricmethodcouldbeappliedinscreeningofhighcellviabilityPichia pastorismutantwithinacertainrange,anditwassimpleandtime-saving.Insummary,TTCcolorimetricmethodprovidedareliableapproachforscreeningofhighcellviabilitystrain.

TTCcolorimetricmethod;Pichia pastoris;viability;optimization;NTG;screening

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21306112)，上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(13ZR1429100)，上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃項(xiàng)目(slg14037)，教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目，上海理工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目，微創(chuàng)勵(lì)志創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(YS30808007)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.004

Q 815

A

1672-5425(2016)10-0018-05

劉勝男，張燕，劉泰瑜，等.TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母突變株[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(10)：18-22.