富鍺蛹蟲草菌絲體主要活性成分分析

陳宏偉，侯進(jìn)慧，陳安徽，秦 杰，時(shí)加美

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

富鍺蛹蟲草菌絲體主要活性成分分析

陳宏偉，侯進(jìn)慧，陳安徽，秦 杰，時(shí)加美

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

以空白蛹蟲草菌絲體凍干粉為材料，測定富鍺蛹蟲草菌絲體胞內(nèi)多糖、有機(jī)鍺、蟲草素、SOD、蛋白質(zhì)及氨基酸含量。結(jié)果顯示，鍺在200～300μg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，對菌絲體的主要活性成分有促進(jìn)作用，濃度過大，對相關(guān)活性成分有抑制作用，不同的生物學(xué)指標(biāo)所需鍺的質(zhì)量濃度各不相同。本研究表明，培養(yǎng)基中鍺濃度對蛹蟲草菌絲體主要活性成分有影響，適宜質(zhì)量濃度的鍺對蛹蟲草菌絲體主要活性成分有促進(jìn)作用。

蛹蟲草；鍺；活性成分

蛹蟲草(Cordyceps militaris (L.) Link)是一種與冬蟲夏草相似的藥食兩用真菌，集提高免疫力、抗癌、保肝、延壽等多種功效于一身[1]，深受消費(fèi)者喜愛。已有研究證實(shí)蟲草無性型發(fā)酵菌絲體的主要有效成份含量與野生型的有效成分含量大致相同，功效相似，甚至某些成分還高于野生蟲草[1-2]。

無機(jī)鍺對人體有毒，是人體非必需的元素，然而近二十多年來人們對有機(jī)鍺的合成、生物活性及其應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的探討。已有研究表明，有機(jī)鍺是一種具有高度生物活性的物質(zhì)，具有抗腫瘤、消炎與免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血脂等多重功能。對高血壓、貧血、骨質(zhì)疏松、感冒、癲癰、慢性萎縮性胃炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、老年性癡呆癥等也有一定療效，含鍺食物和藥物被認(rèn)為是治療癌癥和艾滋病的首選[3-8]。

真菌具有較強(qiáng)的生物富集和轉(zhuǎn)化能力，可以將無機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，降低其毒性，提高其生物活性。關(guān)于金針菇、羊肚菌、靈芝、灰樹花、冬蟲夏草等藥、食真菌的富鍺研究已有相關(guān)報(bào)道[9-11]，而蛹蟲草對鍺的富集作用以及鍺對蛹蟲草相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)影響的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究微量元素鍺對蛹蟲草菌絲體主要活性成分含量的影響，為進(jìn)一步發(fā)揮有機(jī)鍺和蛹蟲草的雙重功效，開發(fā)具有多種功效的蛹蟲草功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富鍺蛹蟲草菌絲體由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存，利用在培養(yǎng)基中加入一定濃度的二氧化鍺進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后經(jīng)離心獲得濕菌絲體，經(jīng)冷凍干燥獲得干燥的富鍺菌絲體。

GeO2(分析純)、95%～98%濃硫酸、硝酸(分析純)、95%乙醇 徐州市科翔化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；鄰苯三酚(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)(G250)上海銳谷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；TGL-20M離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JA2003N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司，BCD-205E/B冷藏冷凍箱 青島海爾股份有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)、TAS-990原子吸收分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CW-2000超聲-微波協(xié)調(diào)萃取儀 上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取和測定

[12]方法進(jìn)行。

1.3.2 鍺的測定

采用原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行測定。分析波長為265.2nm，光譜通帶寬為0.6nm，燈電流為8mA，進(jìn)樣體積為10μL。

鍺標(biāo)準(zhǔn)曲線：按分析條件對2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL鍺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣10μL測定，并求回歸方程。

1.3.3 有機(jī)鍺含量測定

參考文獻(xiàn)[9,11]方法并改進(jìn)。將菌絲體粉碎后經(jīng)透析袋透析，然后將濃縮的樣品直接置于50mL坩堝內(nèi)，于600℃灰化1h以上，冷卻后用30mL體積分?jǐn)?shù)0.5%硝酸少量多次清洗，轉(zhuǎn)移至100mL燒杯中，在磁力攪拌器上邊加熱至60℃以下邊攪拌，使坩堝內(nèi)的灰化物完全溶解，離心分離沉淀，取上清液定容至50mL，待測定。

1.3.4 總鍺含量測定

將菌絲體粉碎后不需透析處理，其余同有機(jī)鍺測定。

1.3.5 有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

1.3.6 蛋白質(zhì)含量的測定

1)取1g菌粉，加入100mL 0.25mol/L氫氧化鈉溶解，在超聲波儀器上處理30min，取上清液加66.2g硫酸銨至95%飽和度，置于4℃冰箱過夜。

2)取出在離心機(jī)上以4000 r/min離心10min，用乙醇-乙醚(2:1)淋洗3次，再離心取出沉淀物，放入電熱恒溫干燥箱干燥后，取出干燥固體，即粗蛋白。

3)將提取好的粗蛋白經(jīng)透析袋透析，每天換2～3次水，使其中剩余的硫酸銨析出。

4)樣品測定：考馬斯亮藍(lán)法測定。將透析后的蛋白質(zhì)取出，加水至20mL，用移液管移取1mL，加蒸餾水稀釋10倍，再加5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長處比色，記錄A595，與標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，經(jīng)回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 氨基酸含量分析

依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法進(jìn)行。

稱取0.1g(精確到0.0001g)樣品于高溫耐壓水解管內(nèi)，加10.0mL 8mol/L鹽酸，充氮?dú)?，然?10℃水解，過濾，稀釋后加緩沖液調(diào)pH值為2.2，12000r/min離心，0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3.8 SOD活力測定

1.3.8.1 SOD的提取

取1g菌絲體，放入小燒杯中，加入10mL蒸餾水浸泡2h以上。將浸泡好的菌絲體進(jìn)行超聲-微波破碎，設(shè)置超聲波為5s開、5s停，共超聲-微波處理破碎300s，破碎后進(jìn)行冷凍離心10min，10000r/min，取上清液，并將上清液定容至50mL，待測。

1.3.8.2 SOD活力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定。將每1mL反應(yīng)液中每1min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定為1個(gè)活力單位。

式中：V總代表反應(yīng)總體積；V樣代表加入樣品液的體積；V定義代表活力單位定義體積(1mL)。

1.3.9 蟲草素含量的測定

樣品的處理及測定：稱取0.5g菌絲體放入燒杯中，加入10mL蒸餾水，然后超聲波破碎30min，10000r/min，－4℃冷凍離心15min，取出上清液，剩余的殘?jiān)^續(xù)加10mL蒸餾水超聲波30min，反復(fù)3次，收集上清液。將收集到的上清液50℃條件下濃縮至少于10mL，定容至10mL。0.45μm微孔濾膜過濾后10μL進(jìn)樣，采用高效液相色譜法測定。

HPLP法測定條件：(1)色譜柱：C18反相色譜柱；(2)流動(dòng)相：15%甲醇+85% pH6.5磷酸緩沖液(Na2HPO4，KH2PO4)，0.01mol/L；(3)流速1mL/min；(4)柱溫：20℃；(5)紫外檢測波長260nm，10μL進(jìn)樣。

根據(jù)蟲草素的HPLC標(biāo)準(zhǔn)圖譜和回歸方程計(jì)算樣品的蟲草素含量?；貧w方程為：Y=91.5645x－0.396(X為蟲草素的含量/mg，Y為峰面積)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鍺對蛹蟲草菌絲體胞內(nèi)多糖含量的影響

圖1 鍺質(zhì)量濃度對蛹蟲草菌絲體胞內(nèi)多糖含量的影響Fig.1 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the content of intracellular polysaccharide in mycelia of Cordyceps militaris

從圖1可以看出，低質(zhì)量濃度的鍺對菌絲體胞內(nèi)多糖含量的生成有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)基中鍺濃度為200μg/mL時(shí)，胞內(nèi)多糖最多，比空白提高1.18倍，當(dāng)鍺質(zhì)量濃度大于200μg/mL時(shí)，胞內(nèi)多糖含量逐漸降低。多重方差分析得知，各組間有顯著差異，F(xiàn)=47.48＞F0.01(5,12)=5.06，鍺質(zhì)量濃度對胞內(nèi)多糖有極顯著影響。2.2 鍺對蛹蟲草菌絲體鍺含量和有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率的影響

圖2 鍺質(zhì)量濃度對蛹蟲草菌絲體內(nèi)鍺含量及有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on germanium content and conversion rate of organic germanium in mycelia of Cordyceps militaris

從圖2可知，菌絲體內(nèi)總鍺、無機(jī)鍺和有機(jī)鍺含量都隨著培養(yǎng)基中鍺質(zhì)量濃度的增大而增加，而有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率在一定鍺質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨培養(yǎng)基中鍺質(zhì)量濃度的增大而增加，在鍺質(zhì)量濃度200μg/mL時(shí)，有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，達(dá)到3.7%，然后隨著培養(yǎng)基中鍺質(zhì)量濃度的增大有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率不斷降低。經(jīng)方差分析得知，總鍺、無機(jī)鍺和有機(jī)鍺各組內(nèi)各濃度之間都存在極顯著差異(P＜0.01)，所以，鍺質(zhì)量濃度對菌絲體內(nèi)鍺含量和有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率具有極顯著影響。

2.3 鍺對蛹蟲草菌絲體蛋白質(zhì)含量的影響

圖3 鍺質(zhì)量濃度對蛹蟲草菌絲體蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the protein content in mycelia of Cordyceps militaris

從圖3可知，低質(zhì)量濃度的鍺可以促使菌絲體蛋白質(zhì)的形成，當(dāng)鍺質(zhì)量濃度在300μg/mL時(shí)，蛋白含量最高達(dá)到372.97mg/g，當(dāng)鍺質(zhì)量濃度過大時(shí)對蛋白質(zhì)的合成有一定影響，但菌絲體對鍺有一定的耐受力，在鍺質(zhì)量濃度在500μg/mL時(shí)菌體的蛋白含量還比空白高，可見蛹蟲草對鍺有較好的耐受力，在實(shí)驗(yàn)鍺質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的生成。方差分析得知，F(xiàn)=8.049＞F0.01(5,12)=5.06，鍺質(zhì)量濃度對菌絲體蛋白的合成具有極顯著影響。

2.4 鍺對蛹蟲草菌絲體氨基酸含量的影響

從表1可以看出，各鍺質(zhì)量濃度組對氨基酸總量和必需氨基酸含量都有影響，使氨基酸總量和必需氨基酸含量都比空白組有提高，鍺質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí)的氨基酸含量最高為33.289%，比空白提高2.49倍。鍺質(zhì)量濃度為300μg/mL時(shí)，必需氨基酸含量最高為11.502%，比空白組提高1.89倍，該質(zhì)量濃度下，必需氨基酸占總氨基酸的比例為實(shí)驗(yàn)組最高，達(dá)到35.617%。當(dāng)高于或低于這個(gè)質(zhì)量濃度，氨基酸含量都有所降低?？瞻捉M的必需氨基酸占總氨基酸的比例是各組中最高的，高達(dá)41.796%。經(jīng)方差分析，各實(shí)驗(yàn)組間具有顯著差異(P＜0.05)。鍺質(zhì)量濃度對菌絲體的氨基酸含量有顯著影響，在鍺質(zhì)量濃度300μg/mL以下時(shí)，對氨基酸有促進(jìn)合成的作用，當(dāng)高于這個(gè)質(zhì)量濃度對氨基酸總量有抑制作用。

2.5 鍺對蛹蟲草菌絲體SOD活力的影響

從圖4可知，在一定鍺質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SOD活力隨著鍺質(zhì)量濃度的增加而增加，在鍺質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，菌絲體內(nèi)SOD活力達(dá)到最大，在鍺質(zhì)量濃度500μg/mL時(shí)，菌體內(nèi)SOD 活力開始降低。經(jīng)方差分析，各實(shí)驗(yàn)組有極顯著差異，F(xiàn)=141.98＞F0.01(5,12)=5.06，鍺質(zhì)量濃度在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對菌絲體SOD活力具有極顯著影響。

表1 不同質(zhì)量濃度鍺對蛹蟲草菌絲體氨基酸含量的影響Table 1 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on amino acid content in mycelia of Cordyceps militaris g/100g

圖4 鍺質(zhì)量濃度對蛹蟲草菌絲體SOD活性的影響Fig.4 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the activity of SOD in mycelia of Cordyceps militaris

2.6 鍺對蛹蟲草菌絲體蟲草素含量的影響

圖5 鍺質(zhì)量濃度對蛹蟲草菌絲體蟲草素含量的影響Fig.5 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the cordycepin content in mycelia of Cordyceps militaris

從圖5及方差分析可以看出，鍺質(zhì)量濃度對菌絲體蟲草素具有極顯著影響，F(xiàn)=6.586＞F0.01(5,12)=5.06。鍺質(zhì)量濃度在300μg/mL時(shí)，蟲草素含量達(dá)到最高，小于該質(zhì)量濃度時(shí)蟲草素含量隨著鍺質(zhì)量濃度的增加而不斷增加，當(dāng)鍺質(zhì)量濃度高于300μg/mL時(shí)蟲草素含量開始下降，但表現(xiàn)出對鍺有一定的耐力，在鍺質(zhì)量濃度500μg/mL時(shí)，菌體的蟲草素含量還比空白組高，是空白組的1.09倍。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明鍺對生物體具有消炎、抗腫瘤、促進(jìn)血液循環(huán)、并對糖尿病、高血壓、胃炎、老年癡呆患者有治療保健作用。其作用機(jī)理主要是通過細(xì)胞的主動(dòng)吸收作用使鍺進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并與有機(jī)羧酸絡(luò)合成鍺鹽，從而影響細(xì)胞某些酶類的活性變化[14]。

有機(jī)鍺具有高度的生物活性，可以通過生物對無機(jī)鍺的富集而獲得。食用菌對鍺的富集作用研究還不是很多。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中加入適量質(zhì)量濃度的鍺對菌絲體蛋白質(zhì)含量、氨基酸含量、蟲草素含量、SOD活性和有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率都有明顯的提高作用，在最適鍺濃度時(shí)，蛹蟲草菌絲體中所測各項(xiàng)活性成分含量提高的幅度較大，在所實(shí)驗(yàn)的鍺質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，鍺質(zhì)量濃度較低或過高時(shí)，對上述各項(xiàng)活性成分含量也有一定的促進(jìn)作用。盡管鍺質(zhì)量濃度不同對各種生理指標(biāo)的影響不同，但總體來看，在供試實(shí)驗(yàn)鍺濃度內(nèi)，上述各種指標(biāo)都比空白有明顯的提高。但是，鍺濃度對胞內(nèi)多糖的影響有所不同，在最適濃度以外的濃度范圍，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量都有所降低，過多的鍺對菌絲體胞內(nèi)多糖的產(chǎn)生有抑制作用，低濃度的鍺對胞內(nèi)多糖的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。這可能主要是因?yàn)椋N主要參與機(jī)體的糖代謝，與糖類的形成和淀粉的貯藏有關(guān)[15]，鍺在低質(zhì)量濃度下，有利于某些酶的合成和增強(qiáng)酶的活性，利于糖類的合成，當(dāng)鍺濃度過高時(shí)可能會(huì)破會(huì)正常的代謝平衡從而影響糖類的代謝，使多糖產(chǎn)量受到抑制。本研究顯示鍺質(zhì)量濃度在200～300μg/mL時(shí)，對于增強(qiáng)蛹蟲草菌絲體的活性物質(zhì)含量是比較適宜的。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林群英, 宋斌, 李泰輝. 蛹蟲草研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2006, 33(4): 154-157.

[2] 王建芳, 楊春清. 蛹蟲草有效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥信息, 2005, 22(5): 30-32.

[3] 劉國湘，胡文祥. 有機(jī)鍺抗癌藥物研究進(jìn)展[J]. 中國藥物化學(xué)雜志,1993, 3(3): 216-221.

[4] PETRA K, ROB R. Analytical product study of germanium-containing medicine by different ICP-MS applications[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2004(18): 9-16.

[5] TAO S H, BOLGER P M. Hazard assessment of germanium supplements[J]. Regul Toxicol Pharmacol, 1997, 25: 211-219.

[6] LUCK B E, MANN H, MELZER H, DUNEMANN L, et al. Renal and other organ failure caused by germanium intoxication[J]. Nephrol Dial Transplant, 1999, 14: 2464-2471.

[7] GERBER G B, LEONARD A. Mutagenicity, carcinogenicity and teratogenicity of germanium compounds[J]. Mutat Res Rev Mutat Res,1997, 387: 141-146.

[8] LIN C H, CHEN T J, HSIEH Y L, et al. Kinetics of germanium dioxide in rats[J]. Toxicology, 1999, 132: 147-153.

[9] 于克學(xué). 冬蟲夏草液體發(fā)酵富集硒、鋅、鍺研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2003.

[10] 陳石良, 許正宏, 陶文沂, 等. 灰樹花富鍺培養(yǎng)研究 [J]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 19(3): 248-251.

[11] 李秋蕊.富鍺羊肚菌菌絲體深層發(fā)酵的研究[D]. 長春: 吉林大學(xué),2005.

[12] 朱蘊(yùn)蘭, 邵穎, 陳安徽, 等. 蛹蟲草多糖對紫外線誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(1): 177-180.

[13] 黨建章, 孫海燕, 許柏球, 等. 富鍺靈芝菌絲體氨基酸及超氧化物歧化酶含量的測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2005, 16(12): 1221-1222.

[14] 康德燦. 金針菇平菇菌絲體富鍺水培試驗(yàn)[J]. 食用菌, 1998, 20(2):10-11.

[15] 王紅庚. 微量元素鍺在靈芝體內(nèi)的富集特性及其分布規(guī)律的研究[D].保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001.

Effect of Germanium in Culture Medium on Main Active Component of Cordyceps militaris

CHEN Hong-wei，HOU Jin-hui，CHEN An-hui，QIN Jie，SHI Jia-mei
(College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221018, China)

Cordyceps militaris was cultured in culture containing certain level of germanium dioxide, and the contents of main active components in the C. militaris mycelia, i.e., intracellular polysaccharide, organic germanium, cordycepin, superoxide dismutase (SOD), protein and amino acids were investigated. Results showed that 200－300μg/mL of germanium dioxide in the culture promoted the content of main active components in the mycelia of C. militaris. However, higher concentration of germanium dioxide inhibited the formation of the above active components.

Cordyceps militaris；germanium；active components

S567.3

A

1002-6630(2010)24-0329-05

2010-09-07

江蘇省“六大人才高峰”項(xiàng)目(06-G-018)

陳宏偉(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：chenhw@xzit.edu.cn