郝媛媛,南曉潔,趙春貴＊,秦雪梅

柴胡栽培種ZQ-T干根藥材的AFLP鑒別

郝媛媛1,南曉潔2,趙春貴1＊,秦雪梅1

(1.山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西太原030006; 2.山西省農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所,山西太原030031)

以干根藥材為材料,采用AFLP技術(shù)進行了柴胡栽培種ZQ-T的鑒別.首先以3個柴胡栽培種干根樣品混合DNA為模板進行AFLP分析,篩選出3對引物,經(jīng)3次重復其DNA指紋圖譜一致.然后以3對引物分別進行了7個栽培種的AFLP分析,每對引物均能從ZQ-T中擴增出特異條帶,將ZQ-T鑒別出來;通過聚類分析,當遺傳相似性系數(shù)分別為0.81、0.86、0.97時(引物分別為E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG和E-AGG/M-CAA)可將7個柴胡栽培種完全區(qū)分開.結(jié)果表明:AFLP可以較好地揭示柴胡種質(zhì)資源的遺傳差異,并可用于柴胡栽培種干根藥材的鑒別.

柴胡;干根;AFLP;藥材鑒別

0 引言

柴胡是我國傳統(tǒng)常用中藥,分布廣泛,藥用歷史悠久.中藥柴胡以根入藥,具解表和里、退熱、疏肝解郁等功效[1,2].《中國藥典》(2005年版)收錄柴胡(Bupleurum chinenseDC.)和狹葉柴胡(Bupleurum scorzonerif olium Willd.)干燥根為正品[3].目前柴胡野生資源瀕臨枯竭,在山西、甘肅、陜西等地出現(xiàn)了大面積的柴胡種植基地[4].在柴胡的栽培過程中形成了一些優(yōu)良品種,經(jīng)藥效成分分析表明山西左權(quán)的種子(ZQ-T)品種優(yōu)良[5],但該栽培種特別是其干根藥材,僅通過傳統(tǒng)的性狀、顯微及理化鑒別較難鑒別[6],因此探索干根藥材鑒別的新方法具有重要意義.

分子標記技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應用使得從DNA分子水平上鑒別中藥成為可能,AFLP技術(shù)已廣泛應用于中藥的遺傳多樣性分析及品種鑒別等方面[7,8].目前已有關(guān)于柴胡ITS序列[9]及RAPD分析[10]等遺傳多樣性的研究,但供試樣品大多是柴胡幼嫩組織,對柴胡進行AFLP分析尤其是對其藥材干根的研究還少見報道.本研究以干根為材料,采用本實驗室改良的CTAB法[11]提取樣品干根DNA并進行了7個柴胡栽培種的AFLP分析,實現(xiàn)對山西左權(quán)種(ZQ-T)的鑒別,以期為柴胡藥材的鑒別和優(yōu)良栽培品種的選育提供方法和參考.

1 實驗部分

1.1 材料和試劑

7個柴胡栽培種兩年以上生干燥根,見表1(P292).聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺,Sigma公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI、MseI,MBI;TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、剝離硅烷、親和硅烷,北京鼎國生物公司;過硫酸銨,北京夏斯生物技術(shù)有限公司;AFLP接頭和引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成.

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及酶切

每個樣品均取30株柴胡干根,粉碎混勻取樣,參照改良CTAB法提取樣品DNA,以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測.將樣品DNA 37℃溫育3 h,65℃溫育3 h,80℃處理20 min,進行限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI雙酶切.

表1 用于AFLP分析的柴胡栽培種T able 1 Bupleurumcultivars used in AFLPanalysis

1.2.2 AFLP條件的優(yōu)化

采用北京鼎國生物公司AFLP分析試劑盒,配合以6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,進行銀染檢測[12,13].按照試劑盒使用說明書和Vos等方法[14],以3個柴胡干根樣品(LX-T、ZQ-T、HC-T)混合DNA為模板進行AFLP條件的優(yōu)化.

酶切DNA片段末段連接人工接頭,16℃連接12 h,65℃加熱10 min以滅活T4 DNA連接酶,4℃保存?zhèn)溆?連接產(chǎn)物稀釋10倍為模板,以E-A和M-C作為引物,進行預擴增.將預擴增產(chǎn)物稀釋20倍[15]為模板, E+3/M+3 64個引物組合分別為引物進行PCR擴增,以篩選選擇性擴增引物.將預擴增產(chǎn)物分別稀釋10倍、20倍、40倍、60倍和80倍作為模板,用篩選出的一對選擇性引物進行PCR擴增,以優(yōu)化選擇性擴增模板的稀釋倍數(shù).以選擇的模板稀釋倍數(shù)和篩選出的選擇性擴增引物,分別進行3次PCR重復擴增,以考察其重復穩(wěn)定性.

1.2.3 柴胡AFLP指紋圖譜的構(gòu)建與聚類分析

在優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上,采用AFLP方法分析了ZQ-T等7個柴胡栽培種.經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯色獲得各栽培種的AFLP指紋圖譜.在相同遷移位置有DNA條帶記為“1”,無條帶則記為“0”,用NTSYS-PC (2.10)軟件按UPGMA法進行聚類分析,獲得柴胡栽培種聚類圖[16,17].

2 結(jié)果與分析

2.1 模板DNA的檢測及酶切

干根樣品DNA及酶切片斷經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖1所示.從7個柴胡栽培種干根樣品中提取的DNA,電泳條帶明亮清晰,經(jīng)EcoR I/MseI雙酶切后,酶切充分,表明DNA純度較高,可用于后續(xù)實驗.

圖1 柴胡干根樣品DNA的提取(a)和EcoRI和MseI雙酶切(b)Fig.1 Extraction and enzyme digestion of DNA samples fromBupleurumcultivars

2.2 AFLP條件的優(yōu)化

2.2.1 選擇性引物的選擇

以AFLP分析試劑盒提供的E+3/M+3組合而成的64對引物進行引物篩選,結(jié)果見圖2(P293),多對引物能夠產(chǎn)生擴增條帶,其中E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG、E-AGG/M-CAA 3對引物DNA擴增條帶豐富,帶型質(zhì)量較好,分辨率較高.

2.2.2 擴增模板濃度的選擇

以預擴增產(chǎn)物稀釋不同倍數(shù)作為模板,E-AAC/M-CTA為引物進行選擇性擴增.結(jié)果表明稀釋倍數(shù)在20～80倍范圍內(nèi)均可得到清晰的AFLP指紋圖譜.

2.2.3 重復性測定

分別以E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG、E-AGG/M-CAA為引物,預擴增產(chǎn)物稀釋80倍作為模板對3個柴胡樣品混合物重復進行3次AFLP分析,3對引物3次擴增均獲得一致的AFLP指紋圖譜,重復性良好.

圖2 E+3/M+3組合64對引物的AFLP指紋圖譜Fig.2 AFLP fingerprinting by E+3/M+3 64 primer pairs

2.3 AFLP指紋圖譜的分析

分別以E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG和E-AGG/M-CAA為引物,對7個柴胡栽培種干根樣品進行了AFLP分析,見圖3.各個柴胡栽培種的AFLP指紋圖譜擴增條帶豐富,帶型清晰穩(wěn)定,其中ZQ-T分別用3對引物擴增出27、25、17條帶,每對引物都可擴增出其特異條帶,雖然不同引物獲得的特異性條帶數(shù)量和位置不同,但均能將ZQ-T從7個栽培種中鑒別出來(表2).

表2 柴胡栽培種ZQ-T的AFLP指紋圖譜條帶分析T able 2 B ands analysis of AFLP fingerprinting forBupleurumcultivar ZQ-T

2.4 聚類分析

7個柴胡栽培種的遺傳關(guān)系聚類圖,見圖3(P294).6號和7號(即XC-T和XC-L)樣品屬于不同栽培地的2個狹葉柴胡栽培種,其它為不同栽培地的5個北柴胡栽培種,通過聚類分析3對引物獲得了相似但不完全相同的聚類圖.北柴胡5個栽培種首先聚為一類,而狹葉柴胡2個栽培種聚為一類,然后二者再聚在一起,與分類學結(jié)果相一致,表明種間差異大于種內(nèi)差異.5個北柴胡栽培種雖然聚為一類,但3對引物獲得的聚類以及兩兩之間的遺傳相似性系數(shù)并不完全一致,表明每一對引物所反映的不是全部而是部分遺傳信息,況且不同引物所分析的位點和數(shù)目也不盡相同,因而其聚類存在有差別.

通過聚類分析,7個栽培種之間的遺傳相似性系數(shù)不同,不但可以將ZQ-T鑒別出來,而且原產(chǎn)地相同,栽培地不同的北柴胡樣品SL-L與SL-T、LX-T與LX-L也能夠相互區(qū)分開.當遺傳相似性系數(shù)分別為0.81、0.86、0.97(引物分別為E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG、E-AGG/M-CAA)時,能夠?qū)?個栽培種完全區(qū)分開,其中引物E-AAC/M-CTA的鑒別效率最高.表明此方法可用于種及種下的鑒別,并可以較好地揭示柴胡種質(zhì)資源的遺傳差異.

3 討論

AFLP分析方法穩(wěn)定可靠,分辨率高,多態(tài)性強,檢測效率高,已廣泛應用于中藥的遺傳多樣性分析及品種鑒別等方面.本文以柴胡栽培種干根藥材為材料,在擴增模板濃度的選擇、引物篩選和重復性試驗的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了7個柴胡栽培種的AFLP指紋圖譜,能夠有效區(qū)分出優(yōu)良品種ZQ-T及不同的柴胡栽培種.這表明AFLP可以較好地揭示柴胡種質(zhì)資源的遺傳差異,可用于柴胡栽培種干根藥材的鑒別.我國柴胡資源豐富,已報道柴胡43種,17變種,7變型[2],還有不同的居群和不同的藥材栽培種,要實現(xiàn)對它們的系統(tǒng)研究非常困難.本研究僅使用3對引物構(gòu)建了7個柴胡栽培種的AFLP指紋圖譜,建立了一個利用AFLP技術(shù)進行柴胡優(yōu)良品種鑒別的方法.隨著研究品種和所用引物數(shù)量的增加,得到的結(jié)果會更加準確,可構(gòu)建出柴胡的標準指紋圖譜庫,就能對柴胡不同種及不同栽培種進行鑒別.

總之,本研究以鑒別優(yōu)良柴胡栽培種干根藥材為目的,篩選到3對引物,建立了柴胡不同栽培種干根AFLP分析方法,從分子水平上對柴胡優(yōu)良栽培種進行了鑒別,結(jié)果反映出不同柴胡栽培種之間的親緣關(guān)系,對于柴胡干根藥材鑒別以及優(yōu)良品種的選育有積極意義.

圖3 柴胡栽培種3對引物的AFLP指紋圖譜及聚類分析Fig.3 AFLP fingerprinting of theBupleurumcultivars by 3 primer pairs and dendrogram of cluster

[1] 李 芳,李建北,張東明,等.柴胡的藥理研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2004,15(2):120-121.

[2] 潘勝利,順慶生,柏巧明,等.中國藥用柴胡原色圖志[M].上海:上?？茖W技術(shù)文獻出版社,2002:15-19.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:198.

[4] 秦雪梅,王玉慶,岳建英,等.栽培柴胡資源狀況分析[J].中藥研究與信息,2005,7(8):30-32.

[5] 李媛媛,秦雪梅,王玉慶,等.北柴胡皂苷類成分的特征(指紋)圖譜研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2007,27(11):1500-1503.

[6] 胡雙豐.柴胡與其混淆品黑柴胡及錐葉柴胡的鑒別[J].藥學實踐雜志,2006(4):222-225.

[7] RAN G,HUANG H,HUANGJ.AFLP Fingerprints Analysis of Fructus Evodiae[J].Bulletin of Botanical Research,2008,28 (6):720-725.

[8] 沈宇峰,孫乙銘,沈曉霞,等.夏枯草種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國中藥雜志,2009,34(3):260-263.

[9] 武 瑩,劉春生,劉玉法,等.5種習用柴胡的ITS序列鑒別[J].中國中藥雜志,2005,30(10):732-734.

[10] 梁之桃,秦民堅,王崢濤,等.柴胡屬5種植物RAPD分析與分類鑒定[J].中草藥,2002,12(33):1117-1119.

[11] 南曉潔,郝媛媛,趙艮貴,等.柴胡藥材干根DNA提取及RAPD分析[J].中草藥,2009,39(11):5-9.

[12] BASSAM B J,CAETANO-ANNOLES G,GRESSHOF P M.Fast and Sensitive Silver Staining of DNA in Polyacrylamide Gels [J].Analytical Biochemistry,1991,196(1):80-83.

[13] CHAL HOUB B A,THIBAULT S,LAUCOU V,et al.Silver Staining and Recovery of AFLP Amplification Products on Large Denaturing Polyacrylamide Gels[J].Biotechniques,1997,22(2):216-220.

[14] VOS P,HOGERS P,BLEEKER M,et al.AFLP:A New Technique for DNA Fingerprinting[J].Nucleic Acids Res,1995,23 (21):4407-4414.

[15] 杜 娟,馬小軍,李學東.半夏不同種質(zhì)資源AFLP指紋系譜分析及其應用[J].中國中藥雜志,2006,31(1):30-33.

[16] 常 青,周開亞.分子進化研究中系統(tǒng)發(fā)生樹的重建[J].生物多樣性,1998,6(1):55-62.

[17] NEI M.Analysis of Gene Diversity in Subdivided Populations[J].Proc Nat Acad Sci USA,1973,70:3321-3323.

Identification on the Medicinal Dried Roots from BupleurumCultivar ZQ-T by AFLP T echnique

HAO Yuan-yuan1,NAN Xiao-jie2,ZHAO Chun-gui1,QIN Xue-mei1
(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University,Taiyuan030006,China; 2.Institution of Crop Germplasim Resources,Shanxi A gricultrue Academy of Science,Taiyuan030031,China)

TheBupleurumcultivar ZQ-T was identificated by AFLP,with the medicinal dried roots as material.3 AFLP primer pairs was screened based on the DNA admixture templates from dried roots of 3Bupleurumcultivars,and the fingerprintings were accordant after amplifying 3 times using each primer pairs.Moreover,7Bupleurumcultivars were analyzed using the 3 primer pairs,respectively.ZQ-T was be distinguished from others because it owned some specific bands on its DNA fingerprintings.On the basis of clustering analysis,the 7 samples of cultivars were divided into 7 clusters when the genetic similarity coefficients were 0.81,0.86 and 0.97,respectively using primer pairs E-AAC/M-CTA,E-AGG/M-CTGand E-AGG/M-CAA,so that all of the 7 medicinal dried root samples of cultivars was distinguished.The results showed that AFLP can be used to study genetic diversity ofBupleurumand identification of medicinal dried root samples fromBupleurumcultivars.

Bupleurum;Dried root;AFLP;medicinal materials identification

R282

A

0253-2395(2010)02-0291-05

2009-07-28;

2009-09-14

國家自然科學基金(30570174)

郝媛媛(1984-),女,山西介休人,碩士研究生,從事生物化學與分子生物學研究.＊通訊聯(lián)系人:E-mail:chungui@ sxu.edu.cn