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      谷朊的糖基化及其谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶脫酰胺改性研究*

      2010-11-02 06:26:30章旭王淼
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2010年11期
      關(guān)鍵詞:溶解性谷氨酰胺糖基化

      章旭,王淼,2

      1(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫,214122) 2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

      谷朊的糖基化及其谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶脫酰胺改性研究*

      章旭1,王淼1,2

      1(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫,214122) 2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

      谷朊富含谷氨酰胺和較多的疏水性氨基酸,具有不溶于水等獨特性質(zhì)。試驗采用糖基化和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對谷朊改性,使蛋白質(zhì)分子帶有更多的極性基團,從而使其功能性質(zhì)得到改善。研究首先在60℃,75%的相對濕度下對谷朊進行糖基化,當(dāng)谷朊與葡萄糖和葡聚糖的質(zhì)量比均為10∶1,Maillard反應(yīng)時間24h,糖基化后的谷朊可利用的ε-NH2分別下降了40%和20%左右。2種糖基化谷朊在底物濃度為5%,谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTG)濃度為100 U/g谷朊,在pH 6.0,37℃條件下進行脫酰胺改性,MTG作用7 h后,葡萄糖和葡聚糖糖基化谷朊氨釋放量分別達到40 μM氨/g蛋白和50 μM氨/g蛋白,高于非糖基化谷朊的31 μM氨/g蛋白,經(jīng)MTG改性后的糖基化谷朊表面疏水性和溶解性有小幅度的提高,但持水性和持油性有較大提高。

      谷朊,谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,糖基化,脫酰胺,改性

      小麥面筋蛋白俗稱谷朊粉,是小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物,由于面筋蛋白含有較多的疏水性氨基酸,分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大,溶解性較低,限制了它在食品中的使用[1]。對富含谷氨酰胺和天冬酰胺的面筋蛋白進行脫酰胺改性,降低它們在蛋白質(zhì)分子中形成氫鍵的能力,從而改善蛋白的功能性質(zhì)可以擴大其使用范圍。脫酰胺改性可通過酸法、堿法及酶法進行。酸性條件下,脫酰胺反應(yīng)是直接水解蛋白質(zhì)的酰胺鍵,脫去一個氨形成羧酸進行[2]。但酸法脫酰胺由于溫度高,不僅在酸的催化下肽鍵水解不好控制,蛋白質(zhì)也會發(fā)生部分變性。用堿催化脫酰胺改性雖然速度快,但使得蛋白質(zhì)中的氨基酸發(fā)生了消旋作用,使必需氨基酸的L-對映體減少和消化率降低,并產(chǎn)生賴丙氨酸,毒理研究表明它對小鼠腎有毒害作用,因此對其研究甚少[3]。

      谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是一種能催化蛋白酰胺鍵脫酰胺能力的酶。它還能通過?;D(zhuǎn)移反應(yīng),催化蛋白側(cè)鏈的酰胺鍵與伯胺反應(yīng),以及酰胺鍵與蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-NH2的交聯(lián)反應(yīng)[4]。氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在食品中的應(yīng)用已有很多報道[4],利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對蛋白進行脫酰胺作用,需要避免蛋白之間因交聯(lián)反應(yīng)而進行的聚合。為了解決這一問題,可以通過蛋白與糖的Maillard反應(yīng)來掩蔽賴氨酸側(cè)鏈上的ε-NH2,盡可能防止交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,并且糖的親水性對面筋蛋白的功能性質(zhì)也有改善[5]。因此,本文利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對糖基化小麥面筋蛋白進行脫酰胺改性研究。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      谷朊粉,周口蓮花味精集團;微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTG,1 600U/g),東海糧油張家港公司;1-苯胺-8-奈磺酸(ANS)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),Sigma公司;氨快速檢測試劑盒,Megazyme公司;葡萄糖、葡聚糖,2萬單位(右旋糖酐),國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

      V1800型可見光分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;Hitachi 650-60熒光分光光度計,日本日立公司;FE20實驗室pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;冷凍干燥機,LABCONCO公司。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 谷朊粉水分含量的測定

      參見 GB5479-1985[6]。

      1.2.2 谷朊粉蛋白質(zhì)含量的測定

      微量凱氏定氮法 GB5511-1985[6]。

      1.2.3 糖基化谷朊的制備

      將谷朊在攪拌條件下分批加入到0.05mol/L磷酸緩沖液中(pH值8.0),配制成5%谷朊懸浮液,以m(谷朊)∶m(糖)=10∶1的配比加入葡萄糖或葡聚糖,攪拌30 min充分混合均勻,將樣品冷凍干燥,凍干后的樣品在60℃,79%的相對濕度下(飽和的KBr維持79%相對濕度)進行美拉德反應(yīng)[7],在不同時間的接枝反應(yīng)下,得到不同接枝度的糖基化谷朊樣品。

      1.2.4 糖基化谷朊的脫酰胺過程

      在酶反應(yīng)器中將糖基化谷朊分散在pH值6.0的0.05mol/L磷酸緩沖液中,配制成1%懸浮液,按加酶量100 U/g谷朊加入MTG,在37℃,pH值6.0條件下反應(yīng)不同時間,而后于90℃滅活5 min使反應(yīng)停止,冷凍干燥,裝袋既得改性樣品,或在不同時間取一定量懸浮液加入等體積的20%TCA溶液,離心,測上清液中氨的含量。

      1.2.5 接枝度的測定

      TNBS法測定自由氨基[8]:準(zhǔn)確稱取40 mg谷朊樣品溶于40mL的0.05mol/L的NaCl,pH值9.2,質(zhì)量濃度2.9g/L的SDS溶液中,攪拌30 min,取上述1mL懸浮液,加入1mL 0.05mol/L的Na2HPO4和1mL質(zhì)量濃度2.9g/L的TNBS溶液,在60℃水浴反應(yīng)2 h,室溫靜置10 min,再加1mL質(zhì)量濃度100g/L的SDS和0.5mL 1mol/L的HCl,在340 nm處測吸光值,空白不加樣品。用相同的方法,以賴氨酸代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)曲線計算樣品中自由氨基的含量C。接枝度的計算公式為:

      其中:C0為接枝反應(yīng)前溶液中自由氨基的含量,mol/L;C1為接枝反應(yīng)后溶液中自由氨基的含量,mol/L。

      1.2.6 脫酰胺過程中氨的測定

      在脫酰胺過程中,在不同的時間取3mL懸浮液,再加等體積的20%TCA溶液,靜置10 min使蛋白質(zhì)沉淀,12 000 r/min離心10 min后,取上清液按氨快速檢測試劑盒使用說明,測氨濃度。

      1.2.7 溶解性的測定

      蛋白溶解性采用氮溶解指數(shù)(NSI%)表示[9]。將1%的樣品溶液,調(diào)節(jié)到pH值8.0,攪拌1 h使樣品溶解,然后離心20 min(4 000 r/min),用福林酚法測上清液蛋白質(zhì)含量,利用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中蛋白質(zhì)含量測定采用微量凱氏定氮法。

      1.2.8 表面疏水性的測定

      采用 ANS熒光探針法[10]。將蛋白樣品溶于0.01mol/L磷酸緩沖液(pH值7)中,分別稀釋成0.5~0.005mg/mL個不同濃度梯度。取不同樣品稀釋液 5mL,加入50μL 8 mmoL/L 的 ANS,振蕩,靜置 3 min,設(shè)定激發(fā)波長338 nm,發(fā)射波長496 nm,狹縫校正5 nm。以熒光強度對蛋白濃度作曲線,初始段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

      1.2.9 持水性的測定

      將1 g左右(G)樣品加入離心管中,連管稱重(m1),再加入10mL蒸餾水,攪拌均勻,在25℃下靜置30 min,4 000 r/min離心10 min,倒出析出水分,連管稱重(m2)。持水性的計算公式為:

      1.2.10 持油性的測定

      方法同持水性測定,用大豆色拉油代替蒸餾水。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 Maillard反應(yīng)時間對接枝反應(yīng)的影響

      本研究選取葡萄糖和葡聚糖與谷朊在10∶1的質(zhì)量比下進行Maillard反應(yīng),通過羰基與氨基的結(jié)合,從而掩蔽面筋蛋白上的氨基。在不同的接枝反應(yīng)時間谷朊接枝度的變化如圖1所示。

      圖1 Maillard反應(yīng)時間對接枝度的影響

      由圖1可知,隨著Maillard反應(yīng)時間的增加,糖與谷朊發(fā)生接枝反應(yīng)的接枝度在不斷增加,24 h后,葡萄糖與谷朊的接枝度達到了45%,葡聚糖與谷朊的接枝度達到了20%。由于谷朊的溶解性很差,對糖與谷朊的接枝反應(yīng)有一定的阻礙,所以總體谷朊的接枝度不高。相同反應(yīng)時間下,葡萄糖與谷朊的接枝度要高于葡聚糖與谷朊的接枝度,可能是由于單糖的分子量要小于多糖,更有利于Maillard反應(yīng)的發(fā)生。為了使糖基化谷朊更好地發(fā)生脫酰胺反應(yīng)而不發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),改善谷朊的水溶性等特性,后期MTG的處理選擇氨基掩蔽程度較高的糖基化24 h谷朊,一方面氨基掩蔽程度高的谷朊可以在MTG作用下更好發(fā)生脫酰胺反應(yīng),另一方面大量接枝到谷朊上的糖鏈可以增強蛋白的親水作用。

      2.2 糖基化谷朊在MTG作用下的脫酰胺作用

      2種糖基化谷朊和非糖基化谷朊在MTG(100 U/g谷朊)作用下,發(fā)生脫酰胺反應(yīng),同時可能存在少量的交聯(lián)反應(yīng),反應(yīng)釋放氨的量在一定程度上可反映樣品的脫酰胺程度。

      由圖2可知,在MTG作用開始的1 h內(nèi),非糖基化谷朊氨釋放量要稍高于葡萄糖和葡聚糖糖基化24 h的谷朊,2 h后,非糖基化谷朊氨釋放量速度降低,MTG作用3 h后2種糖基化谷朊氨釋放量要明顯高于非糖基化谷朊,其中葡聚糖糖基化谷朊又高于葡萄糖糖基化谷朊。這是因為MTG優(yōu)先催化交聯(lián)反應(yīng)。在反應(yīng)初期,由于體系的蛋白質(zhì)中可能存在伯胺,特別是非糖基化谷朊中伯胺含量相對較高,故在MTG的作用下,非糖基化的谷朊氨的釋放較快。但反應(yīng)1 h后,糖基化谷朊氨的釋放速度和釋放量明顯高于非糖基化谷朊,反應(yīng)轉(zhuǎn)向脫酰胺,而且葡聚糖糖基化谷朊由于連接上大分子的葡聚糖,對于蛋白鏈的展開作用要大于連接上單糖的葡萄糖糖基化谷朊,故更易發(fā)生脫酰胺反應(yīng),氨的釋放量也較大。

      圖2 MTG催化谷朊改性過程中氨的釋放

      2.3 MTG作用時間對糖基化谷朊表面疏水性的影響

      谷朊在MTG的作用下表面疏水性的變化,可以反映出蛋白質(zhì)分子相互作用的結(jié)構(gòu)變化。

      由圖3可知,非糖基化谷朊和2種糖基化24 h的谷朊在MTG作用開始的1 h內(nèi),表面疏水性有顯著的升高,1 h后,非糖基化谷朊和葡萄糖糖基化谷朊的表面疏水性升高趨勢變緩,葡聚糖糖基化谷朊的表面疏水性有一定程度的波動,總體趨于平緩。在MTG作用的開始1 h,可能由于交聯(lián)作用,使谷朊的內(nèi)部大量疏水基團暴露,連接葡萄糖和葡聚糖的糖基化谷朊對蛋白鏈的展開有一定的促進作用,所以表面疏水性增加較大,MTG作用后期,發(fā)生脫酰胺作用,對蛋白表面疏水性影響不明顯。

      2.4 MTG作用時間對糖基化谷朊功能性質(zhì)的影響

      糖基化谷朊在MTG(100 U/g谷朊)的作用下,進行交聯(lián)和脫酰胺反應(yīng),隨著脫酰胺程度的增加,谷朊的功能性質(zhì)也在發(fā)生相應(yīng)的改變,如溶解性、持水性和持油性等。

      2.4.1 MTG作用時間對糖基化谷朊溶解性的影響

      由圖4可知,糖基化谷朊在MTG的作用下,氮溶解指數(shù)都有一定程度的增加,2種糖基化谷朊分別從12%和15%增加到20%,而非糖基化谷朊在MTG的作用下,氮溶解指數(shù)也有所提高,但只達到了16%,谷朊的氮溶解指數(shù)在10%左右。葡聚糖糖基化24 h的谷朊在MTG作用1.5 h后溶解性快速提高,可能是因為后期主要發(fā)生了較多的脫酰胺反應(yīng)所致[11]。糖基化谷朊在MTG作用下,溶解性的提高,一方面可能由于親水性的糖鏈接枝到谷朊上,另一方面由于MTG的脫酰胺作用,使酰胺鍵變?yōu)橛H水側(cè)鏈的羧基,使蛋白鏈展開,暴露了更多的親水基團。

      圖3 MTG作用時間對糖基化谷朊表面疏水性的影響

      圖4 MTG作用時間對糖基化谷朊溶解性的影響

      2.4.2 MTG作用時間對糖基化谷朊持水性的影響

      由圖5可知,糖基化谷朊和非糖基化谷朊在MTG的作用下,持水性隨酶反應(yīng)時間的增加而升高,在開始1 h內(nèi)持水性增加趨勢明顯,1 h后持水性呈緩和的增加趨勢,在MTG作用下,糖基化谷朊持水性高于于非糖基化谷朊,葡萄糖糖基化谷朊高于葡聚糖糖基化谷朊。MTG的脫酰胺作用使蛋白鏈展開,親水基團暴露,使連接糖鏈的谷朊更易具有親水性,從而持水性增加,以及谷朊上氨基掩蔽率越高,不利于發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而更多的發(fā)生脫酰胺反應(yīng),從而更好地改善其持水性。

      2.4.3 MTG作用時間對糖基化谷朊持油性的影響

      由圖6可知,糖基化谷朊和非糖基化谷朊在MTG的作用下,在起始的1 h,持油性明顯增加,可能是由于交聯(lián)作用和疏水基團的暴露,1 h后糖基化谷朊持油性有所下降,3 h后非糖基化谷朊持油性下降明顯,可能是由于后期MTG對蛋白的脫酰胺作用使酰胺鍵轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性帶負(fù)電荷的羧基。糖基化谷朊上連接的糖鏈也在一定程度上增加了其持油性。

      圖5 MTG作用時間對糖基化谷朊持水性的影響

      圖6 MTG作用時間對糖基化谷朊持油性的影響

      3 結(jié)論

      谷朊與葡萄糖、葡聚糖在進行美拉德反應(yīng)24 h后,谷朊上的ε-NH2分別下降了40%和20%左右。利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTG)對2種糖基化24 h的谷朊進行改性,在MTG酶量為100 U/g谷朊,37℃,pH 6.0的條件下進行交聯(lián)和脫酰胺反應(yīng),隨著反應(yīng)的進行氨釋放量在不斷增加,溶解性都有一定程度的提高,持水性有很大的提高,持油性在MTG作用前期提高很大,后期有一定的下降,但都高于非糖基化谷朊。

      [1]Barber Kathleen J,Warthesen Joseph J.Some functional properties of acylated wheat gluten[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,1982(20):930-934.

      [2]Akio Kato,Atsushi Tanaka,Naotoshi Matsudomi,et al.Damidation of food proteins by protease in alkaline pH[J].Food Chemistry,1987,35:224-227.

      [3]馬興盛,候立琪,李紅梅.小麥面筋蛋白的改性技術(shù)[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,17(2):21-22.

      [4]鄭美英,陳堅,倫世儀,等.谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的理化性質(zhì)、生產(chǎn)方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].生物工程進展,2001,21(1):33-37.

      [5]Oliver C M,Melton et al.Creating proteins with novel functionality via the Maillard reaction:A review[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2006,46:337-350.

      [6]王肇慈.糧油食品品質(zhì)分析[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2000:349-361.

      [7]鐘芳,麻建國,王璋,等.蛋白質(zhì)-多糖共價復(fù)合物[J].食品科技,2000(5):20-26.

      [8]Jacques G,Sophie B,Dieter Schwenke K,et al.Effect of succinylation on some physicochemical and functional properties of the 12S storage protein from rapeseed[J].J Agric Food Chem,1990,38:61-69.

      [9]Govindaraju K,Srinivas H.Studies on the effects of enzymatic hydrolysis on functional and physicochemical properties of arachin[J].LWT,2006,39:54-62.

      [10]Kato A,Sasaki Y,F(xiàn)uruta R.Functional protein-polysaccharide conjugate prepared by controlled dry-heating of ovalbumin-dextran mixtures[J].Agricutural and Biological Chemistry,1990,54(1):107-112.

      [11]Yong Y H,Yamaguchi S,Matsumura Y.Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of wheat gluten[J].J Agric Food Chem,2006,54:6 034-6 040.

      Study on Deamidated Modification of Maillard Conjugated Wheat Gluten with Carbohydrates by Microbial Transglutaminase

      Zhang Xu1,Wang Miao1,2
      1(School of Food Science and Technology,Jianghan university,Wuxi 214122,China)2(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

      Wheat gluten is rich with glutamine and hydrophobic amino acids,and has some unique properties such as poor water-solubility,etc.To improve its functional properties gluten was modified by glycosylation followed by microbial transglutaminase(MTGase)deamidation with increasing polar groups on gluten.In this study,firstly,wheat gluten was incubated 24 hours with glucose or dextran at 60℃and 75%relative humidity to promote the formation of Maillard reaction.Available ε-NH2groups of wheat gluten were masked approximately 40%and 20%respectively.A 5%suspension solution of glycosylated glutens was to be deamidated by MTGase 100 U/g gluten at 37℃,pH 6.0 for 7 h,the amount of NH3released during the reaction reached 40 μM NH3/g protein and 50μM NH3/g protein while the amount of NH3released reached 31μM NH3/g protein to un-glycosylated glutens.After gluten was glycosylated followed by MTGase reaction,the surface hydrophobicity and the solubility property were slightly increased.The water holding capacity and oil holding capacity were raised effectively by deamidation.

      wheat gluten,microbial transglutaminase,maillard reation,deamidation,modification

      碩士研究生(王淼教授為通訊作者)。

      *國家自然科學(xué)基金面上項目(20776063)

      2010-06-17,改回日期:2010-09-15

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