丁安子,方桂杰,高 琴,謝衛(wèi)紅

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430068）

含酯血紅蛋白分子印跡膜的制備

丁安子,方桂杰,高 琴,謝衛(wèi)紅

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430068）

以丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯為功能單體、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑、牛血紅蛋白為模板分子,采用溶液聚合法,合成了具有選擇識(shí)別性的牛血紅蛋白分子印跡膜。結(jié)果表明,引入疏水性功能單體甲基丙烯酸甲酯,通過(guò)氫鍵和疏水作用的協(xié)同作用,蛋白質(zhì)印跡膜的專一選擇性得到顯著提高。

蛋白質(zhì)分子印跡膜;牛血紅蛋白;協(xié)同作用

分子印跡技術(shù)（Molecular imp rinted technology,M IT）指人工合成具有專一性識(shí)別作用受體的新技術(shù)。由于其良好的耐熱與耐化學(xué)性能以及高的專一選擇性,在色譜柱固定相及固相提取[1～3]、生物傳感器敏感元件[4]、模擬酶催化[5～7]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)是以蛋白質(zhì)為模板的一種大分子印跡技術(shù),一般采用水溶性功能單體并在水相中以氫鍵與模板蛋白形成復(fù)合物,但在水相中形成氫鍵容易受水分子的干擾,影響了印跡孔穴的形成和印跡聚合物的選擇識(shí)別能力。研究表明,利用不同功能單體的協(xié)同作用可顯著提高蛋白質(zhì)分子印跡聚合物的專一選擇性。宓懷風(fēng)等合成了具有輔助識(shí)別聚合物鏈的新型單體,該單體可與功能單體丙烯酰胺組成多重有效的識(shí)別位點(diǎn),有效提高印跡聚合物的專一選擇性[8,9]。Shea等以蜜蜂蜂毒毒素為模板、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,使用丙烯酰胺（AAm）、丙烯酸（AAc）、N2叔丁基丙烯酰胺（TBAm）等多種功能單體,利用多種作用力（氫鍵、正電荷靜電作用力、負(fù)電荷靜電作用力、疏水作用力）協(xié)同作用的方法,提高印跡納米微球的選擇性[10]。

作者在此采用溶液聚合法,以牛血紅蛋白為模板蛋白,在使用水溶性功能單體丙烯酰胺的基礎(chǔ)上,引入疏水性功能單體甲基丙烯酸甲酯,以N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑,采用氧化還原引發(fā)體系引發(fā)聚合反應(yīng),在玻片上制備了具有選擇性識(shí)別能力的含酯牛血紅蛋白分子印跡膜。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血紅蛋白（BHb）、肌紅蛋白（Mb）、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）,Sigma公司;牛血清蛋白（BSA）,B.M公司;溶菌酶（Lyz）,Am2 ersco公司;丙烯酰胺,Canalab公司;甲基丙烯酸甲酯（MMA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二甲基亞砜（DM 2 SO）、戊二醛,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;32氨丙基三乙氧基硅烷（WD250）,武漢大學(xué)新有機(jī)硅有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

UV2Lambda 35型紫外可見分光光度計(jì),美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.2 蛋白質(zhì)分子印跡膜的制備

含酯印跡膜的制備：取丙烯酰胺84 mg、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺9 mg以及甲基丙烯酸甲酯42μL溶于1 mL除氧后的DM SO;以除氧后的p H值為6.40的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配制2×10-4mol·L-1BHb溶液。等體積混合上述單體溶液和模板蛋白溶液,并在氬氣保護(hù)下,加入0.1 mg·mL-1過(guò)硫酸銨40μL和 TEM ED 6μL。取混合溶液滴于玻片上,使其聚合成膜。生成的印跡膜（M IP）用1%SDS210%HAc洗脫液于脫色搖床上洗脫至紫外檢測(cè)不到模板分子為止,然后用去離子水洗凈殘留 SDS。以1 mL PBS代替模板蛋白溶液,同法制備非印跡膜（N IP）。

無(wú)酯印跡膜的制備：取丙烯酰胺111 mg、N,N′2亞甲基雙丙烯酰胺9 mg溶于1 m L除氧后的PBS,其余步驟同上。引發(fā)劑用量為0.1 mg·mL-1過(guò)硫酸銨20μL、TEM ED 3μL。

1.3 重結(jié)合性能的檢測(cè)

為了檢測(cè)M IP膜的重結(jié)合能力,向放置M IP膜的燒杯中加入1μmol·L-1BHb溶液3 m L,4℃下靜置;每隔一段時(shí)間取200μL溶液用紫外分光光度計(jì)于405 nm處測(cè)其吸光值,計(jì)算蛋白濃度,按下式計(jì)算重結(jié)合蛋白量（B）。

式中：c0為初始蛋白質(zhì)濃度;ct為不同時(shí)間的蛋白質(zhì)濃度;V為蛋白質(zhì)溶液體積。

1.4 印跡膜專一選擇性

為檢測(cè)印跡膜的專一選擇性,選取Lyz、M b和BSA為參比蛋白。向放置M IP膜及N IP膜的不同燒杯中 ,分別加入10μmol·L-1Lyz溶液、1μmol·L-1M b溶液、1μmo l·L-1BHb溶液、10μmol·L-1BSA溶液各3 m L,4℃下靜置10 h。用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光值,并計(jì)算重結(jié)合蛋白量（B）。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡膜制備條件的確定

2.1.1 溶劑的選擇

MM A不溶于水,考慮到不同溶劑對(duì)聚合反應(yīng)速率的影響[11],以溶解度和能否成膜為標(biāo)準(zhǔn),考察DM 2 SO、二甲基甲酰胺（DM F）和甲醇三種溶劑的溶解性及對(duì)成膜的影響,結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑的溶解性及對(duì)成膜的影響Tab11 Solubility in different solventsand the im pact on the film

由表1可以看出,DMSO與甲醇均具有較好的溶解性,但甲醇無(wú)法形成膜狀印跡聚合物;DM SO與DM F均可制備分子印跡膜,但DM F對(duì)牛血紅蛋白的溶解能力要小于DM SO。故選擇DM SO作為溶劑。

2.1.2 酯加量的確定

Shea等研究發(fā)現(xiàn),以50%AAc和40%TBAm制得的印跡聚合物重結(jié)合蛋白量大于以5%AAm&AAc和40%TBAm制得的印跡聚合物,即多種功能單體以多種作用力協(xié)同作用時(shí),存在最佳單體配比[10]。

在此以MMA取代部分AAm,在保證功能單體總摩爾數(shù)不變的情況下,研究MMA與AAm的不同配比對(duì)印跡膜重結(jié)合蛋白量（便于比較,均指單位面積重結(jié)合量,下同）的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 酯加量對(duì)印跡膜重結(jié)合蛋白量的影響Fig.1 Effect of MMA dosage on rebinding protein amount on imprinted membrane

由圖1可知,隨著酯加量的增加,M IP膜重結(jié)合蛋白的量逐漸增加;當(dāng)酯加量增至25%時(shí),M IP膜重結(jié)合蛋白量達(dá)到最大;隨后M IP膜的重結(jié)合蛋白量開始減少。由圖1還可知,隨著酯加量的增加,N IP膜重結(jié)合蛋白量增加不明顯。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著酯加量的增加,含酯膜的顏色從無(wú)色透明逐漸變?yōu)槿榘咨?剛性也顯著提高。當(dāng)酯加量超過(guò)25%時(shí),膜變得易碎,且不易從玻片揭下來(lái),影響了對(duì)模板蛋白的重結(jié)合。

2.1.3 引發(fā)劑用量的確定

引發(fā)劑用量決定引發(fā)體系自由基的量,從而影響聚合度。由于溶劑DM SO造成的阻聚作用[11]以及MMA較低的鏈增長(zhǎng)常數(shù)[12],為保證完全聚合需增大引發(fā)劑用量。以無(wú)酯印跡膜引發(fā)劑量（0.1 mg·mL-1過(guò)硫酸銨 20μL、TEM ED 3μL）為初始引發(fā)劑量,分別提高2～3倍,考察其對(duì)含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 引發(fā)劑用量對(duì)含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量的影響Fig.2 Effect of in itiator dosage on rebinding protein amount on M IP containing ester

由圖2可以看出,當(dāng)引發(fā)劑用量為2倍用量時(shí),含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量顯著提高;繼續(xù)增大至3倍用量時(shí),含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量變化不大。這是因?yàn)?一方面隨著引發(fā)劑用量的增加,含酯M IP膜聚合度也增加,形成更多的印跡孔穴;另一方面,隨著引發(fā)劑用量的增加,聚合速率也加快,聚合時(shí)間縮短,DM 2 SO對(duì)蛋白的變性作用也減小,有效印跡孔穴增加,因此,當(dāng)引發(fā)劑用量為2倍用量時(shí),印跡膜的聚合度已達(dá)到最佳,繼續(xù)增大引發(fā)劑用量,重結(jié)合蛋白量無(wú)變化。2.1.4 重結(jié)合時(shí)間的確定（圖3）

圖3 含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量隨時(shí)間變化曲線Fig.3 The change curve of rebinding protein amount on M IP contain ing ester vs.rebinding time

由圖3可見,在最初的0～4 h內(nèi),含酯M IP膜重結(jié)合蛋白量顯著增加;在4～8 h時(shí),重結(jié)合蛋白量的增加趨緩,8 h后吸附達(dá)到平衡。這是因?yàn)橹亟Y(jié)合時(shí),BHb先與膜表面及淺層印跡孔穴發(fā)生相互作用,由于膜表層空間位阻小,結(jié)合速度快;當(dāng)淺層的孔穴飽和后,BHb向膜內(nèi)部印跡孔穴擴(kuò)散,直至達(dá)到靜態(tài)吸附平衡,此時(shí)空間位阻增大,故結(jié)合速度變慢。因此,為保證含酯M IP膜與BHb充分結(jié)合,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中重結(jié)合時(shí)間均選擇10 h。

2.1.5 BHb濃度的確定

利用靜態(tài)平衡吸附法在0.1～1.0μmol·L-1濃度范圍內(nèi)進(jìn)行重結(jié)合,結(jié)果如圖4所示。

由圖 4可知,當(dāng)BHb濃度在 0.1～0.4μmol·L-1范圍內(nèi),重結(jié)合蛋白量顯著增加;當(dāng)BHb濃度在0.4～0.8μmol·L-1范圍內(nèi) ,增速變緩;當(dāng) BHb 濃度超過(guò)0.8μmol·L-1時(shí),重結(jié)合蛋白量達(dá)到飽和。因此,為保證含酯M IP膜與BHb充分結(jié)合,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中BHb濃度均選擇1.0μmol·L-1。

2.2 選擇性吸附

圖4 含酯M IP膜在不同BHb濃度下重結(jié)合蛋白量Fig.4 Rebinding protein amoun t on M IP contain ing ester at different concentrations of BHb

3種參比蛋白中,溶菌酶（Lyz）作為分子量小、體積小的參比蛋白的代表;肌紅蛋白（M b）作為分子量小、體積小但具有類似于模板蛋白結(jié)構(gòu)的參比蛋白的代表;牛血清蛋白（BSA）作為分子量略大、體積近似于模板蛋白的參比蛋白的代表。結(jié)果表明,含酯M IP膜對(duì)模板蛋白 BHb具有相對(duì)較高的重結(jié)合蛋白量,Lyz、M b、BSA的重結(jié)合蛋白量遠(yuǎn)小于模板蛋白,這表明含酯M IP膜具有一定的選擇性。含酯 NIP膜對(duì)4種蛋白的重結(jié)合蛋白量較為接近,沒(méi)有選擇性。

以印跡影響因子α來(lái)評(píng)價(jià)印跡膜的專一選擇性。

顯然,α值越大,表明M IP膜相對(duì)于N IP膜對(duì)客體分子的識(shí)別性越好。

將含酯印跡膜與無(wú)酯印跡膜對(duì)4種蛋白的重結(jié)合量進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如圖5和表2所示。

圖5 含酯印跡膜和無(wú)酯印跡膜對(duì)不同蛋白重結(jié)合蛋白量的對(duì)比Fig.5 Contrast of rebinding amoun t of different protein on im printed membrane with ester or without ester

表2 含酯印跡膜和無(wú)酯印跡膜對(duì)不同蛋白的α值Tab12 The values ofαof different proteins on imprinted membrane with ester or without ester

由圖5和表2可知,隨著疏水性功能單體MM A的引入,印跡膜對(duì)模板蛋白的重結(jié)合量顯著增加,α值也隨之增加,這說(shuō)明印跡膜的專一選擇性得到了提高,這與Shea等的結(jié)果相符合[10]。隨著選擇性的提高（MMA的引入）,3種參比蛋白的α值都有一定程度的降低。尤其是M b,其含酯M IP膜的重結(jié)合蛋白量明顯減少。這可能是由于引入疏水性功能單體后,通過(guò)氫鍵和疏水作用力的協(xié)同作用,提高了含酯印跡膜的專一選擇性,可正確識(shí)別模板蛋白BHb與其結(jié)構(gòu)類似的蛋白M b。

3 結(jié)論

引入疏水性功能單體MMA后,通過(guò)與丙烯酰胺的協(xié)同作用,所制備的含酯印跡膜對(duì)模板蛋白BHb的專一選擇性明顯提高,尤其是對(duì)結(jié)構(gòu)類似蛋白M b的識(shí)別能力得到了提高。該法為有效提高蛋白質(zhì)等生物大分子的印跡聚合物的專一選擇性提供了一條新的途徑。

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Preparation of Hemoglobin M olecular Imprinted Membrane Contain ing Ester

D ING An2zi,FANG Gui2jie,GAO Qin,XIEWei2hong
（Key L aboratory of Fermentation Engineering for M inistry of Education,College of B ioengineering,H ubei University of Technology,W uhan430068,China）

By aqueous solution polymerization,the bovine hemoglobin molecular imp rinted membraneswere synthesized w ith acrylamide and methylmethacrylate as the functionalmonomers,N,N′2methylenebisacrylam2 ide as the crosslinker,and bovine hemoglobin as the temp late.The results showed that the specific selectivity of bovine hemoglobin molecular imp rinted membrane was significantly increased by introducing hydrophobic monomer methylmethacrylate into the polymer.The increase of the selectivity was due to the cooperation of hydrogen bonding and hydrophobic action.

p rotein molecular imp rinted membrane;bovine hemoglobin;multisite interaction

O 641.3

A

1672-5425（2010）06-0024-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20875024/B0509）,湖北省教育廳重大研究項(xiàng)目（Z20081402）

2010-04-19

丁安子（1982-）,男,湖北人,碩士研究生,研究方向：生物化工;通訊作者：謝衛(wèi)紅,博士,教授。