李素梅,江志強(qiáng),孫冬梅,羅文匯,范宋玲

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州510405;2.廣東省中醫(yī)研究所,廣東 廣州510095)

三七消散丸由三七、白花蛇舌草、夏枯草等藥物組成,具有化瘀解毒、軟堅(jiān)散結(jié)的功效,主要用于各類腫塊、痰火凝結(jié)之瘰疬及痰核等。為了更好地控制其質(zhì)量、保證臨床療效,本研究采用薄層色譜法對(duì)制劑中的三七、白花蛇舌草、夏枯草進(jìn)行定性鑒別,并采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法對(duì)制劑中三七所含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器、試劑與試樣

1.1 儀 器

Camag Tlc Sampler4型自動(dòng)點(diǎn)樣儀,瑞士Camag公司產(chǎn)品;Camag Reprostar3 薄層成像系統(tǒng),瑞士Camag公司產(chǎn)品;Agilent1200高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,美國(guó)格雷斯奧泰公司產(chǎn)品;SartoriusBP211D電子分析天平,德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品;KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器,上海楚定分析儀器有限公司產(chǎn)品;電熱恒溫水浴槽,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;PBQ-Ⅱ型薄層自動(dòng)鋪板器,重慶南岸新力實(shí)驗(yàn)電器廠產(chǎn)品。

1.2 試劑與試樣

白花蛇舌草對(duì)照藥材(批號(hào)121183-200402)、夏枯草對(duì)照藥材(批號(hào)120993-200604)、三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)110745-200415)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)110703-200726)及人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)110704-200420),均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;三七消散丸,由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供,批號(hào)20090302, 20090303, 20090304;乙腈為進(jìn)口色譜純,美國(guó)Honeywell公司產(chǎn)品;水為屈臣氏蒸餾水,廣州屈臣氏食品飲料有限公司產(chǎn)品,批號(hào)20090103;正丁醇,天津大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品,批號(hào)20090408;甲醇(批號(hào)20090220)、乙酸乙酯(批號(hào)20081009)、石油醚(30～60 ℃,批號(hào)20090301)、乙醚(批號(hào)20081206)及氨水(批號(hào)20090302-1),均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;無(wú)水乙醇(批號(hào)20081203),天津大茂化學(xué)試劑廠;其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 三七的薄層色譜鑒別

取本品 2 g, 研細(xì), 加石 油醚(30～60 ℃)50 mL,加熱回流30 min,棄去石油醚液;藥渣揮干后,加水飽和正丁醇20 mL,超聲處理30 min;濾過(guò);濾液加氨試液洗滌兩次,每次20 mL;棄去氨試液,正丁醇液蒸干;殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液。另取三七對(duì)照藥材0.5 g,加水飽和正丁醇20 mL,超聲處理30 min,同法制成對(duì)照藥材溶液。再按處方比例,取缺三七的其他各味藥,按制備工藝加工制成陰性樣品,按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)。吸取上述3 種溶液各2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上;以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(5→50)(4∶1∶5)上層液為展開劑,置于氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)展開;取出,晾干;噴以10%硫酸乙醇溶液;于105 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰;置于紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果:供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2 白花蛇舌草的薄層色譜鑒別

取本品3 g,研細(xì),加水100 mL,煮沸30 min,濾過(guò),濾液濃縮至約30 mL,加乙酸乙酯萃取兩次,每次20 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液。另取白花蛇舌草對(duì)照藥材1 g,加水100 mL,煮沸30 min,同法制成對(duì)照藥材溶液。再按處方比例,取缺白花蛇舌草的其他各味藥,按制備工藝加工制成陰性樣品,按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn),吸取上述3種溶液各8 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上;以三氯烷-甲醇-乙酸(9︰2︰0.05)為展開劑展開;取出,晾干;噴以10%硫酸乙醇溶液,于105 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果:供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.3 夏枯草的薄層色譜鑒別

取本品5 g,研細(xì),加水100 mL,煮沸30 min,濾過(guò),濾液濃縮至約30 mL,加鹽酸調(diào)pH值為2～3,加乙醚振搖提取3次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。另取夏枯草對(duì)照藥材1 g,加水100 mL,煮沸30 min,濾過(guò),同法制成對(duì)照藥材溶液。再按處方比例,取缺夏枯草的其他各味藥,按制備工藝加工制成陰性樣品,按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》 2005年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn),吸取上述3種溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上;以甲苯(水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶1.2)為展開劑展開;取出,晾干;噴以5%三氯化鐵乙醇溶液, 105 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果:供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

3 定量分析

參照文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行。

3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 適量, 加甲醇制成每毫升含三七皂苷 R1 0.106 2 mg、人參皂苷Rg1 0.489 6 mg、人參皂苷Rb1 0.390 4 mg的混合液。

3.2 供試品溶液的制備

取本品適量,研細(xì),取約2.0 g,精密稱定;置索氏提取器中,加石油醚(30～60 ℃)水浴上回流提取1 h;棄去石油醚(30～60 ℃)液;藥渣揮干溶劑后,再加甲醇回流提取4 h;濾過(guò);濾液蒸干,殘?jiān)铀?5 mL使溶解;加水飽和正丁醇振搖提取3次,每次20 mL;合并正丁醇液;用氨試液洗滌兩次, 每次30 mL;棄去氨試液;正丁醇液蒸干;殘?jiān)蛹状际谷芙?轉(zhuǎn)移并定容至25 mL量瓶中;加甲醇定容至刻度,搖勻,備用。

3.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例,取缺三七的其他各味藥,按制備工藝加工制成陰性樣品,按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.4 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性條件

色譜柱:HpersilODS柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相內(nèi)乙腈-水, 梯度洗脫(0～12 min,乙腈 19%→36%;12～21 min, 乙腈36%);流速 1 mL/min;ELSD檢測(cè)器漂移管溫度45 ℃;載氣流速1.5 L/min。在上述色譜條件下,三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 及人參皂苷Rb1三者能較好地分離。見(jiàn)圖1。

圖1 三七消散丸HPLC-ELSD圖

3.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液4, 5, 6, 8, 10 μL注入液相色譜儀,以峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),以進(jìn)樣量(μg)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品回歸方程

結(jié)果表明:三七皂苷R1在 0.424 8～1.062 0μg、人參皂苷Rg1在1.958 4～4.896 0 μg、人參皂苷Rb1在1.561 6～3.904 0 μg之間,其自然對(duì)數(shù)值與峰面積自然對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液(批號(hào)20090302)5 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1平均峰面積及峰面積RSD見(jiàn)表2～4。

表2 三七皂苷R1精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 人參皂苷Rg1精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 人參皂苷Rb1精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取同 1 份供試品溶液(批號(hào)20090302)5 μL,分別于0, 2, 4, 8, 12 h進(jìn)樣5 μL,按3.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1 及人參皂苷Rb1 峰面積 RSD分別為1.12%、0.95%、0.85%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取供試品(批號(hào)20090302)5份,分別按照3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:三七皂苷R1 平均含量為 2.35 mg/g,RSD=1.09%;人參皂苷Rg1平均含量為8.85 mg/g,RSD=1.01%;人參皂苷Rb1平均含量為6.84 mg/g,RSD=0.98%。表明該方法重現(xiàn)性好。

3.9 加樣回收率測(cè)定

取6 份已知含量的樣品(批號(hào) 20090302)約1.0 g,精密稱定質(zhì)量,分別精密加入一定量的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1對(duì)照品,按3.2項(xiàng)下供試品制備方法處理,進(jìn)樣5 μL,按3.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表5～7。

表5 三七皂苷R1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n=6

表6 人參皂苷Rg1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n=6

表7 人參皂苷Rb1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n=6

3.10 供試品測(cè)定結(jié)果

分別精密吸取對(duì)照品溶液5 μL、10 μL及供試品溶液5 μL,注入液相色譜儀,用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算,即得。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 供試品含量測(cè)定結(jié)果 n=3

4 討 論

三七中所含的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1均為四環(huán)三萜皂苷類成分,其最大吸收波長(zhǎng)在203 nm左右,在紫外區(qū)屬于末端吸收,在分析過(guò)程中往往會(huì)受到溶劑干擾,噪音信號(hào)大,靈敏度較低,采用紫外檢測(cè)器時(shí),樣品分離度差,分析時(shí)間長(zhǎng),較難獲得滿意結(jié)果。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為一種質(zhì)量通用型檢測(cè)器,它的響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)特性,任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)。本文采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,參照文獻(xiàn)[1]中三七藥材含量測(cè)定流動(dòng)相,并加以調(diào)整,建立了三七消散丸中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的含量測(cè)定方法,并通過(guò)方法學(xué)考察驗(yàn)證,結(jié)果顯示,該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,精密度好,能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1含量。

本文所確定的方法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠,可作為三七消散丸的質(zhì)量控制方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[ M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:10-11.