康新 劉國(guó)輝 路小光 范治偉 白黎智 劉莉 龐洪剛 康利民 紀(jì)春陽(yáng)

·短篇論著·

Toll樣受體4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在重癥急性胰腺炎肺損傷中的表達(dá)及血必凈的干預(yù)作用

康新 劉國(guó)輝 路小光 范治偉 白黎智 劉莉 龐洪剛 康利民 紀(jì)春陽(yáng)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是重癥急性胰腺炎(SAP)最常見(jiàn)的早期并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)33%，發(fā)病1周內(nèi)病死的SAP患者中60%～80%與ALI/ARDS有關(guān)[1-2]。Toll樣受體(TLR)家族成員在識(shí)別病原體并介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)中具有重要作用，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括NF-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和應(yīng)激活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3-4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血必凈干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)ALI的大鼠，觀察其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB表達(dá)的影響，探討血必凈的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康清潔級(jí)SD大鼠96只，體重(220±20)g，雌雄不拘，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后抽簽法隨機(jī)分為假手術(shù)組、ANP并發(fā)ALI(ANP-ALI)組和血必凈組，每組32只。采用胰膽管逆行緩慢注射4%?；悄懰徕c(美國(guó)Sigma公司)1 ml/kg體重方法制備ANP-ALI模型。同時(shí)選取空腸起始部以下約2 cm處置入造瘺管經(jīng)由皮下引出體外，妥善固定。假手術(shù)組觸摸胰腺數(shù)次及空腸造瘺后關(guān)腹。血必凈組于制模后0.5 h經(jīng)瘺管注入血必凈(天津紅日藥業(yè)有限公司贈(zèng)送)2 ml；假手術(shù)組和ANP-ALI組注入等容積生理鹽水。術(shù)后3、6、12、24 h分批處死大鼠8只，取血及胰腺、肺組織。

2．血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2、內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量測(cè)定：用全自動(dòng)生化儀(57600-010，日本日立公司)測(cè)定血清淀粉酶、Ca2+含量。Bayer血?dú)夥治鰞x測(cè)定血PaO2、PaCO2。應(yīng)用內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒(天津一瑞生物工程有限公司)在MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)中檢測(cè)血清內(nèi)毒素含量，按說(shuō)明書(shū)操作，由標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血清內(nèi)毒素含量。采用ELISA法檢查血清TNF-α、IL-1β含量，試劑盒購(gòu)自Sigma公司,按說(shuō)明書(shū)操作。

3．肺組織病理學(xué)檢查、肺損傷評(píng)分以及濕/干重比測(cè)定：取右肺上、中葉，常規(guī)病理檢查，采用Osman等[5]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺損傷評(píng)分。取左肺稱(chēng)重，置80℃電熱干燥箱內(nèi)烤72 h ，再稱(chēng)干重，按[(肺濕重-肺干重)/ 肺干重]×100%計(jì)算肺組織濕/干重比(W/D)。

4．肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè)：取100 g右下肺組織，電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿， BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)行Western blotting?？筎LR4、NF-κB一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，ECL發(fā)光劑顯影后硝酸纖維素膜在FluorSMutilmager圖像分析儀上用QuantityOne4.1圖像分析軟件進(jìn)行分析，以相應(yīng)蛋白條帶面積的平均灰度值表示TLR4、NF-κB p65活化水平的相對(duì)含量。

二、結(jié)果

1．血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2、內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量的變化：ANP-ALI組術(shù)后血清淀粉酶、內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量及PaCO2較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而血必凈組較ANP-ALI組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。ANP-ALI組術(shù)后血Ca2+、PaO2均較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，而血必凈組較ANP-ALI組顯著升高(P<0.05，表1)。

2．肺組織病理學(xué)改變和濕/干重比：ANP-ALI組術(shù)后3 h肺組織輕度水腫，鏡下見(jiàn)間質(zhì)水腫、充血、少量單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；6、12 h病變加重；術(shù)后24 h肺呈暗紅色，出現(xiàn)片狀出血及淤血改變，切面有大量暗紅色血性液體滲出，鏡下見(jiàn)肺泡和間質(zhì)重度水腫、出血，肺泡間隔增寬，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)紊亂。血必凈組各時(shí)間點(diǎn)肺組織的損傷均較ANP-ALI組明顯減輕(圖1)。ANP-ALI組的肺損傷評(píng)分及濕/干重比均較假手術(shù)組顯著增加，而血必凈組較ANP-ALI組顯著降低(P<0.05或P<0.01，表2)。

3．肺組織TLR4、NF-κB p65表達(dá)變化： ANP-ALI組TLR4和NF-κB p65表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而血必凈組較ANP-ALI組顯著降低(P<0.05，圖2，表2)。

表1 各組血清淀粉酶、Ca2+、PaO2、PaCO2及血清內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β含量

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，bP<0.01；與ANP-ALI組比較，cP<0.05，dP<0.01；1 mmHg=0.133 kPa

表2 肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比及TLR4、NF-κB p65表達(dá)變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，bP<0.01；與ANP-ALI組比較，cP<0.05，dP<0.01

圖1假手術(shù)組(a)、ANP-ALI組(b)和血必凈組(c)術(shù)后3(上)、24 h(下)的肺組織病理改變(HE ×200)

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組肺組織TLR4與NF-κB的表達(dá)

討論研究發(fā)現(xiàn)，SAP常伴發(fā)腸源性?xún)?nèi)毒素(LPS)血癥，在推動(dòng)ANP-ALI病程發(fā)展中起重要作用[6-7]。Toll受體家族既是LPS的信號(hào)分子，也是LPS的受體。分布在單核巨噬細(xì)胞表面的TLR4對(duì)LPS炎癥信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)起主要作用，是LPS的優(yōu)先受體[8]。NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞中具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，它能參與多種炎癥細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，參與多種疾病過(guò)程。NF-κB與基因啟動(dòng)子和(或)增強(qiáng)子中特定的κ序列結(jié)合，啟動(dòng)和調(diào)控眾多參與炎癥過(guò)程細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)。近年研究表明，TLR與其配體相結(jié)合后激活NF-κB移入核內(nèi)，進(jìn)一步使TNF-α、IL-1β、 IL-6、 IL-8等炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)[9-10]。本結(jié)果顯示，ANP-ALI組大鼠血淀粉酶、PaCO2、內(nèi)毒素及肺組織學(xué)評(píng)分、TNF-α、IL-1β水平均較假手術(shù)組增高，肺組織

TLR4和NF-κB表達(dá)也同步增加，說(shuō)明ANP大鼠肺組織TLR4和NF-κB也參與了ALI的發(fā)病過(guò)程。

中藥血必凈注射液的主要有效成分包括紅花、黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶醛等。血必凈干預(yù)后血清淀粉酶、內(nèi)毒素水平、肺損傷評(píng)分、肺濕/干重比均較ANP-ALI組明顯降低；肺組織TLR4、NF-κB表達(dá)也較ANP-ALI組明顯下降，其下游的TNF-α、IL-1β促炎癥因子表達(dá)也降低。因此推測(cè)血必凈可能在ANP-ALI病程早期抑制腸道內(nèi)細(xì)菌易位，減少了腸源性?xún)?nèi)毒素的產(chǎn)生，降低了內(nèi)毒素對(duì)TLR4的刺激能力，隨后通過(guò)抑制NF-κB p65活化，下調(diào)TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的釋放，從而減輕肺組織損傷，阻止SAP的病程進(jìn)展。

[1] Wig JD,Bharathy KG,Kochhar R,et al.Correlates of organ failure in severe acute pancreatitis.JOP, 2009,10:271-275.

[2] Shaheen MA,Akhtar AJ.Organ failure associated with acute pancreatitis in African-American and Hispanic patients.J Nat Med Assoc,2007,99:1402-1406.

[3] Takagi Y,Masamune A,Kume K,et al.Microsatellite polymorphism in intron 2 of human Toll-like receptor 2 gene is associated with susceptibility to acute pancreatitis in Japan.Hum Immunol,2009,70:200-204.

[4] Sharif R,Dawra R,Wasiluk K,et al.Impact of toll-like receptor 4 on the severity of acute pancreatitis and pancreatitis-associated lung injury in mice.Gut,2009,58:813-819.

[5] Osman MO，Jacobsen NO，Kristensen JU,et al．A monoclonal anti-interleukin 8 antibody(WS-4) inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe actue necrotising pancreatitis in rabbits．Gut，1998，43:232-239．

[6] Matsuda N,Nishihira J,Takahashi Y,et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in acute lung injury in mice with acute pancreatitis complicated by endotoxemia.Am J Respir Cell Mol Biol,2006,35:198-205.

[7] Inoue K,Takano H,Yanagisawa R,et al.Protective effects of urinary trypsin inhibitor on systemic inflammatory response induced by lipopolysaccharide.J Clin Biochem Nutr,2008,43:139-142.

[8] Vabulas RM，Ahmad-Nejad P，da Costa C，et al．Endocytosed HSP60s use Toll-like receptor 2 and TLP4 to activate the Toll/interleukin-1 receptor signaling pathway in innate immune cells．J Biol Chem，2001，276：31332-31339．

[9] Musikacharoen T，Matsuguchi T，Kikuchi T，et al．NF-kB and STAT5 play important roles in the regulation of mouse Toll-like receptor 2 gene expression．J Immunol，2001，166：4516-4524．

[10] Pandey S，Agrawal DK．Immunobiology of Toll-like receptors:Emerging trends.Immunol Cell Biol,2006,84A:333-341．

2010-02-22)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.019

116001 大連，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診外科(康新、路小光、范治偉、白黎智、劉莉、龐洪剛、康利民、紀(jì)春陽(yáng)) ；吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科 (劉國(guó)輝)

路小光，Email：kangxinhao1@yahoo.com.cn