天南星中草酸鈣的形態(tài)及其對釘螺作用的研究

喻振森，柯文山

(湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人民健康、影響社會經(jīng)濟發(fā)展的寄生蟲病[1].釘螺(OncomelaniahupensisGredler)是日本血吸蟲(SchistosomajaponicumKatsurade)的惟一中間宿主,抑制釘螺傳播擴散是阻斷血吸蟲病傳播的重要手段.目前,殺滅釘螺的主要方法仍然是采用化學(xué)藥物氯硝柳胺,但該藥品種單一,且易造成野外生境破壞.研制高效、價廉、對環(huán)境無污染的滅螺藥物是國內(nèi)外學(xué)者重點研究課題,其中植物殺螺劑成為其研究的熱點[2-4].

天南星(ArisaemaerubescensSchott)屬天南星科多年生草本植物，生長于林下陰濕環(huán)境，分布廣泛，是一種重要藥物資源.柯文山等[5]研究證實天南星植物浸出液具有較好的滅螺效果.同時，吳皓等[6]證實天南星植物中的主要刺激性物質(zhì)為內(nèi)含的草酸鈣針晶.這里以天南星中刺激性物質(zhì)草酸鈣針晶為研究對象，確定其在滅螺過程中所起的作用.

1 材料和方法

1.1實驗材料實驗用釘螺采自湖北省公安縣疫區(qū)，經(jīng)無氯水清洗后，以無氯水飼養(yǎng).天南星采自湖北省恩施市利川市.

1.2 天南星中草酸鈣形態(tài)觀察

1.2.1 提取草酸鈣針晶 參照鐘凌云[7]等提取草酸鈣針晶的方法作輕微改動，稱取50 g天南星干燥塊莖，磨成粉末，溶于500 mL水中，然后在600～1 200 r/min轉(zhuǎn)速下，梯度離心，取上清液中層部分，合并干燥，即可獲得草酸鈣針晶.

1.2.2 確定草酸鈣針晶在天南星中的位置 參照楊捷頻[8]的實驗方法對天南星塊莖進行石蠟切片觀察.首先取新鮮天南星塊莖，切成1 cm3的小塊，經(jīng)過70%的FAA固定，梯度酒精脫水，然后進行浸蠟處理，包埋后按12 μm的厚度進行切片，再用番紅染色，最后制成裝片封固即可觀察.

1.3 草酸鈣針晶對釘螺的抑制情況研究

1.3.1 用草酸鈣針晶進行滅螺活性檢測 將提取草酸鈣針晶分別配成5 、2.5 、1 g/L的溶液，用浸殺法進行滅螺實驗，每組放10只釘螺；另外取草酸鈣化合物配置同樣的3個濃度溶液進行滅螺實驗作為比較.每組實驗重復(fù)3次，設(shè)置清水對照組，記錄釘螺的死亡數(shù).

1.3.2 檢測草酸鈣針晶對釘螺活動的影響 取直徑為20 cm的培養(yǎng)皿，在其上均勻分布放置20個釘螺，并標(biāo)記放置位置.用配置的5、2.5 g/L的草酸鈣針晶和草酸鈣化合物溶液滴在釘螺上，劑量以將釘螺剛好浸沒液滴為宜，同時以清水為對照.間隔一段時間后測量記錄釘螺的爬行距離.

1.3.3 掃描電鏡檢測釘螺表面損傷情況 將1 g/L的天然草酸鈣處理釘螺1、2 d的樣品、1 g/L草酸鈣化合物處理1 d的釘螺樣品以及清水對照的釘螺樣品，解剖鏡下去殼,取釘螺組織置于2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，然后經(jīng)乙醇梯度脫水，乙腈置換，真空干燥，鍍金膜，最后在Hitachi S2570 型掃描電鏡下觀察并拍照.

1.4統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS17.0軟件對兩種不同形態(tài)的草酸鈣的殺螺率進行統(tǒng)計分析.進行多因素方差分析，對不同材料，不同濃度，不同時間的處理均進行顯著性差異檢測.

2 結(jié)果與分析

圖1 草酸鈣針晶在天南星中的形態(tài)特征

2.1草酸鈣針晶在天南星植株中的分布及其形態(tài)觀察由圖1(a～c)可以看出，天南星塊莖中草酸鈣針晶呈簇狀分布，即大量草酸鈣單晶集體分布某一區(qū)域，而且晶體簇的顆粒較大，晶體簇大小一般為天南星體細胞體積的30倍左右，均勻散布于天南星塊莖中，并且晶體簇多分布于塊莖中的成熟組織中(圖1b)，靠近分生組織部分晶體簇相反分布較少(圖1a).在圖1d中天南星中草酸鈣晶體是一種單體針晶，細長，兩端尖，經(jīng)測量長度大約為30～50 μm，一般多數(shù)針晶是聚合一起并行排列.

2.2草酸鈣針晶的滅螺活性檢測由表1可以得出24 h后，5 g/L的草酸鈣針晶致死率為63.33%，而2.5 g/L濃度的致死率僅為10%.到72 h后5 g/L的濃度致死率趨近于100%，同時2.5 g/L濃度的致死率達到26.67%.而草酸鈣針晶與草酸鈣化合物在滅螺效果上相差無幾，經(jīng)方差分析，草酸鈣針晶同草酸鈣化合物的作用無顯著性差異(P>0.05).5 g/L時針晶滅螺率從24 h，48 h到72 h依次是63.33%，80.00%,93.33%;而化合物滅螺率依次是53.33%，73.33%，93.33%，可見兩種物質(zhì)對釘螺都有一定的致死作用.經(jīng)方差分析，兩種物質(zhì)對釘螺的致死作用較清水水對照均有顯著性差異(P<0.05)，同時隨著時間的延長致死效果加重.

表1 不同濃度的草酸鈣針晶與草酸鈣化合物對釘螺的殺螺效果(死亡率/%)

*與清水對照組相比，P<0.05.

2.3草酸鈣針晶對釘螺上爬的抑制作用根據(jù)釘螺爬行的距離，將釘螺的爬行能力分成不同的等級，假定A1表示釘螺爬動的距離為0 cm，A2表示釘螺爬動距離為0～3 cm，A3表示釘螺爬動距離為3 cm以上.

表2 不同濃度的草酸鈣針晶和草酸鈣化合物對釘螺上爬的影響 只

由表2的數(shù)據(jù)可以看出清水中釘螺的爬動情況和用草酸鈣化合物處理組的情況相差不大，而且不同濃度的草酸鈣化合物對釘螺的爬動影響不大.而草酸鈣針晶對釘螺的爬動有較強的抑制作用.這說明，草酸鈣針晶對釘螺的活動能力影響效果強，并且低濃度(1 g/L)便能抑制釘螺的爬動.

圖2 釘螺掃描電鏡圖 (圖a～d、g、h,bar=7.5 μm；圖e,bar=30 μm；圖f，bar=17.6 μm)圖a、c、e、g分別為清水對照、1 g/L草酸鈣針晶處理1 d、1 g/L草酸鈣針晶處理2 d、1 g/L草酸鈣化合物處理1 d的釘螺肝臟表面掃描圖；圖b、d、f、h分別為清水對照、1 g/L草酸鈣針晶處理1 d、1 g/L草酸鈣針晶處理2 d、1 g/L草酸鈣化合物處理1 d的釘螺足部肌肉掃描圖

2.4草酸鈣針晶對釘螺損傷的電鏡檢測結(jié)果正常的釘螺肝臟表面皺褶規(guī)律，表面平滑,并且足部肌肉表面皺褶規(guī)律(圖2a、b)；用 1 g/L的天然草酸鈣針晶處理1 d的釘螺肝臟表面，皺褶已趨于平坦，而且表面灰暗，失去原有的光澤，并且足部肌肉突起明顯皺縮，應(yīng)由肌肉收縮引起(圖2c、d)；用1 g/L的天然草酸鈣針晶處理達到2 d后釘螺的肝臟表面已經(jīng)出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象，皺褶已逐漸凸顯，足部肌肉收縮已經(jīng)有所舒展，但是也出現(xiàn)部分潰爛現(xiàn)象(圖2e、f)；1 g/L的草酸鈣化合物處理1 d釘螺的肝臟表面皺褶同樣趨于平坦，光澤也較淡,其足部肌肉皺褶趨于平坦，光澤也較差(圖2g、h).掃描電鏡中所表現(xiàn)出來的特征進一步驗證了草酸鈣針晶對釘螺活動抑制的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為，其致使釘螺足肌皺縮，無法活動.

3 討論

天南星，別名又稱一把傘南星，是多年生草本植物.中醫(yī)理論[9]認為天南星味苦、辛、性溫，有毒，具有燥濕化痰，祛風(fēng)止痛、散結(jié)消腫等功效.柯文山等[5,10]已經(jīng)研究證實天南星有較好的滅螺效果，并且能有效阻止釘螺的上爬行為,但對天南星植物抑制釘螺上爬的物質(zhì)尚為未知.同時，吳皓等[11]研究說明天南星屬中的刺激性主要是由于其內(nèi)部含有草酸鈣針晶，另外他們還研究證實草酸鈣的這種刺激性主要是由于天南星植物中草酸鈣針晶的特殊結(jié)構(gòu)造成的，即其草酸鈣針晶是一種蛋白質(zhì)結(jié)合草酸鈣形成的一種特殊針晶.經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)天南星中的草酸鈣晶體是一種單體針晶的形式，在天南星塊莖中呈簇狀分布(如圖1c).在進行草酸鈣針晶滅螺活性檢測的時候我們發(fā)現(xiàn)，草酸鈣針晶對釘螺的致死作用并不及其全株的滅螺效果，5 g/L的濃度處理3 致死率才達到93.33%.這種致死效果同草酸鈣化合物相差無幾，但是經(jīng)過掃描電鏡的檢測發(fā)現(xiàn)：草酸鈣針晶具有草酸鈣化合物所不具有的對釘螺具有一定的刺激作用，能使釘螺的肌肉收縮，這同表2中釘螺上爬實驗的結(jié)論一致：即草酸鈣針晶為天南星中抑制釘螺上爬的主要物質(zhì).

目前來說，化學(xué)滅螺的研究雖然已初見成效，但是氯硝柳氨[12]等化學(xué)藥物對其他的生物也存在不同的抑制作用，所以人們抑制在探索一種行之有效的植物滅螺途徑.皂甙[13-14]，生物堿[15]等植物中提取的物質(zhì)已經(jīng)被人們證實具有較強的滅螺活性，但是這類藥物有促進釘螺逃逸的現(xiàn)象，所以探索一種既具有滅螺效果，又能將釘螺控制在疫區(qū)的滅螺試劑抑制使人們探索的關(guān)鍵.本文中就天南星中提取的草酸鈣針晶進行了滅螺測試，發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)能夠解決常規(guī)滅螺方法導(dǎo)致的釘螺逃逸問題.

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