RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)菜豆莢斑駁病毒的研究

聞偉剛, 楊翠云, 崔俊霞, 張 穎

(1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局,寧波 315012; 2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135)

菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我國對(duì)外公布的檢疫性有害生物,該病毒可通過種子傳播,引起大豆產(chǎn)量的下降并降低大豆品質(zhì)[1]。因此,加強(qiáng)對(duì)該病毒的檢測(cè)具有重要的意義。

目前,針對(duì) BPMV的檢測(cè)方法主要有 DASELISA和RT-PCR技術(shù)[2-4]。相比傳統(tǒng)的電鏡觀察和生物學(xué)鑒定,這2種方法在檢測(cè)周期方面具有明顯的優(yōu)勢(shì),操作也更為簡單。隨著實(shí)時(shí)熒光 RTPCR技術(shù)的發(fā)展[5-7],因其具有高特異和高靈敏的優(yōu)點(diǎn),針對(duì)BPMV的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)也有了詳細(xì)的研究[8]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)作為一種新穎的核酸擴(kuò)增方法,同樣具有檢測(cè)速度快、操作簡單和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴(kuò)增的Bst DNA聚合酶,在等溫條件下可高效、快速和特異地?cái)U(kuò)增靶序列[9]。由于LAMP呈瀑布式擴(kuò)增,因此其擴(kuò)增效率非常高;同時(shí),LAMP識(shí)別靶序列上的6～8個(gè)特異性位點(diǎn),其特異性也很強(qiáng);LAMP只在60～65℃進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增,只要水浴鍋即可,無需特殊的儀器,操作非常簡單;而且 LAMP的整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)只需1.5～2.5 h,檢測(cè)周期非常短?；贚AMP技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn),本文針對(duì)菜豆莢斑駁病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法的建立進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菜豆莢斑駁病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自美國Agdia公司,樣品狀態(tài)為新鮮葉片經(jīng)液氮處理,磨成粉末狀,冷藏于4℃冰箱保存。含有BPMV的陽性樣品為從美國進(jìn)口的大豆種子,經(jīng)普通 RT-PCR與DAS-ELISA檢測(cè)確證含有BPMV[4]。南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)、南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)以及番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)等陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也都購自美國Agdia公司。

RT-LAMP引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。核酸提取試劑Trizol購自上海生物工程公司。RT-ULAMP擴(kuò)增試劑盒購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司。One-step RNA PCR kit與 DL-2000 Marker購自大連TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

引物序列見表1。根據(jù)GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中已登錄的菜豆莢斑駁病毒的外殼蛋白基因序列(M62738),采用Blast程序進(jìn)行同源性比較,在序列的保守區(qū),使用Primer Express 3.0軟件 ,設(shè)計(jì)得到 F3 、B3、FIP(F1c+TTTT+F2)、BIP(B1c+TTTT+B2)、Loop1和 Loop2共 6條引物,分別識(shí)別外殼蛋白編碼基因的8個(gè)位點(diǎn)。

表1 RT-LAMP檢測(cè)菜豆莢斑駁病毒的引物

1.3 菜豆莢斑駁病毒的RT-LAMP擴(kuò)增

1.3.1 總RNA提取

采用Trizol試劑方法提取[4]。

1.3.2 RT-LAMP擴(kuò)增

反應(yīng)體系:2×U-LAMP Mix 10μL,引物F3和B3的終濃度各為0.2μmol/L,Loop1和Loop2的終濃度各為0.8μmol/L,FIP和BIP的終濃度各為1.6μmol/L,Bst DNA 聚合酶(5 U/μL)1.5μL,AMV RNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL,模板 RNA 1μL,用dd H 2O補(bǔ)充至總體積20μL。

反應(yīng)條件如下:在恒溫60℃的水浴鍋中擴(kuò)增1 h。

1.3.3 RT-LAMP結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后,取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在GelDoc-2000(Bio-Rad)凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.4 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

抽提得到南方菜豆花葉病毒、南芥菜花葉病毒、大豆花葉病毒、煙草環(huán)斑病毒以及番茄環(huán)斑病毒等幾種侵染大豆的植物病毒RNA,按照建立的菜豆莢斑駁病毒RT-LAMP檢測(cè)方法,進(jìn)行特異性研究。健康大豆種子提取液作為陰性對(duì)照。

1.5 菜豆莢斑駁病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立

RT-PCR反應(yīng)體系參照One-step RNA PCR kit試劑盒說明進(jìn)行,其中引物為F3和B3。反應(yīng)條件如下:50℃cDNA合成30 min,94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,60℃復(fù)性 30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸 5 min。

1.6 RT-LAMP的檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)

將提取好的菜豆莢斑駁病毒RNA模板進(jìn)行10倍系列稀釋 ,得到 10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5稀釋的病毒 RNA樣品。采用建立的 RT-LAMP和RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增靈敏度比對(duì)試驗(yàn)。

1.7 進(jìn)境樣品中BPMV的RT-LAMP檢測(cè)

選取20份從美國進(jìn)境的大豆樣品,通過樣品處理得到總RNA[4],采用建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆莢斑駁病毒的RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果

菜豆莢斑駁病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和含有BPMV的陽性美國大豆樣品RNA經(jīng)過RT-LAMP擴(kuò)增后,均能夠得到特異性的瀑布狀條帶,而其他病毒毒株的RNA模板則無擴(kuò)增條帶出現(xiàn),也未從健康大豆種子提取液的RNA模板中擴(kuò)增到特異性基因條帶(圖1)。這表明本研究設(shè)計(jì)的6條引物針對(duì)BPMV的檢測(cè)具有非常好的保守性與特異性。

2.2 RT-LAMP檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)

不同稀釋梯度的菜豆莢斑駁病毒RNA經(jīng)過RT-LAMP擴(kuò)增后,其檢測(cè)靈敏度為10-3病毒稀釋液(圖2a),比普通RT-PCR方法的檢測(cè)靈敏度高出1 000倍(圖2b)。

圖1 RT-LAMP擴(kuò)增菜豆莢斑駁病毒

圖2 RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)菜豆莢斑駁病毒的靈敏度

2.3 大豆樣品的RT-LAMP檢測(cè)

針對(duì)20份從美國進(jìn)境的大豆樣品,預(yù)先采用DAS-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果判定為BPMV陽性。然后采用本研究建立的 RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè),均可獲得陽性結(jié)果。

3 討論

自環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立以來,該方法已被逐漸應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲等的檢測(cè)。2004年,Fukuta等用免疫捕獲RT-LAMP方法檢測(cè)感染菊花的番茄點(diǎn)狀枯萎病毒,結(jié)果顯示,免疫捕獲RTLAMP的敏感性比RT-PCR高出100倍[10]。Hong等用LAMP方法檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒,與傳統(tǒng) RT-PCR方法相比,靈敏度高出100倍,可在1 h內(nèi)獲得結(jié)果,最短為11 min[11]。秦智鋒等建立口蹄疫病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法,從核酸抽提到檢測(cè)僅需75 min,并采用加入熒光染料SYBR green I直接進(jìn)行肉眼或紫外照射觀察陽性結(jié)果[12]。

本研究建立的菜豆莢斑駁病毒RT-LAMP檢測(cè)方法,針對(duì)RNA的稀釋液進(jìn)行靈敏度研究表明,該方法的檢測(cè)靈敏度比RT-PCR高1 000倍,從核酸抽提到結(jié)果觀察的整個(gè)檢測(cè)周期約2～2.5 h,因此,具有靈敏、快速和特異性高的優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí),該方法也存在不足的地方,首先是引物的設(shè)計(jì),針對(duì)8個(gè)基因位點(diǎn)共設(shè)計(jì)6條引物,缺乏專門的RTLAMP引物設(shè)計(jì)軟件,只能采用普通PCR引物設(shè)計(jì)軟件,其引物設(shè)計(jì)和評(píng)估的難度比較大;另外,FIP和BIP引物因堿基數(shù)多且使用量大,檢測(cè)成本較高。其次,在本研究過程中,曾采用熒光染料 SYBR green I進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的觀察,雖然陽性結(jié)果在紫外照射下能夠顯示白色發(fā)光,但陰性和空白對(duì)照同樣有白色發(fā)光,這使得在現(xiàn)場很難判定陽性結(jié)果,而只能用電泳方法進(jìn)行判斷。SYBR green I染料的工作原理是只要擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)雙鏈DNA,就會(huì)嵌入當(dāng)中而發(fā)出熒光,RT-LAMP共使用了6條引物約200個(gè)堿基,在實(shí)際擴(kuò)增中往往會(huì)出現(xiàn)一定程度的自環(huán)化現(xiàn)象,從而導(dǎo)致陰性和空白對(duì)照也出現(xiàn)熒光反應(yīng)。最后,RT-LAMP的瀑布狀擴(kuò)增產(chǎn)物與傳統(tǒng)的PCR特異性條帶存在差異,這會(huì)使得研究人員在結(jié)果判定方面不適應(yīng)。

RT-LAMP方法不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備,隨著該技術(shù)的不斷完善與改進(jìn),將會(huì)建立起一種成本低廉的檢測(cè)體系,從而在病原檢測(cè)和疾病快速診斷等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

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