在北京和河北局部地區(qū)Q型煙粉虱取代了B型煙粉虱

潘慧鵬, 戈大慶, 王少麗, 吳青君, 徐寶云, 謝 文, 張友軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

煙粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]屬半翅目,粉虱科,是一種世界性的多食性害蟲,以植物韌皮部汁液為食,通過直接刺吸為害、傳播植物病毒、引起植物生理混亂、分泌蜜露誘發(fā)真菌病害給作物生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。依據(jù)其寄主范圍、生殖力、為害習(xí)性和傳毒能力等方面的差異,至少可以分為24種生物型[3],其中B型煙粉虱是近20年來傳播世界各地并暴發(fā)成災(zāi)的重要入侵害蟲[3-6],在我國華北和其他地區(qū)發(fā)生并造成嚴(yán)重的危害[7],應(yīng)用分子生物學(xué)等手段研究發(fā)現(xiàn)在北京市發(fā)生為害的煙粉虱主要是B型煙粉虱[8-11]。近年來,隨著花卉和其他經(jīng)濟(jì)作物苗木的調(diào)運(yùn),Q型煙粉虱有從其起源地伊比利亞半島向世界各地?cái)U(kuò)張蔓延的趨勢。在中國,Q型煙粉虱首次于2003年在云南昆明市的一品紅上發(fā)現(xiàn)[12],隨后在北京、河南、浙江、山東、江蘇等地都發(fā)現(xiàn)了Q型煙粉虱[13-15]。

不同生物型的煙粉虱在形態(tài)學(xué)上極其相似,但在酯酶多態(tài)性、核酸多態(tài)性等方面則存在明顯的差異。而快速鑒定煙粉虱的生物型是進(jìn)一步深入研究、制定相關(guān)防治措施的前提。本文利用兩種方法進(jìn)行煙粉虱生物型的鑒定。第1種是Shatters,Jr等[16]設(shè)計(jì)的B型煙粉虱和Q型煙粉虱的mtDNA COⅠ基因片段特異性引物,PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接判斷煙粉虱的生物型。第2種是應(yīng)用Simon等[17]設(shè)計(jì)的煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段通用引物,PCR產(chǎn)物通過測序判定煙粉虱的生物型。上述兩種方法都證實(shí)了2009年采集自蔬菜所3個(gè)試驗(yàn)基地的煙粉虱種群為Q生物型,同時(shí)也驗(yàn)證了Shatters,Jr等[16]設(shè)計(jì)的B型煙粉虱和Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段的特異性引物能夠很好地鑒別B型煙粉虱和Q型煙粉虱。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

所用的煙粉虱種群于2009年采自蔬菜所的3個(gè)試驗(yàn)基地(表1);對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的B型煙粉虱種群。

表1 2009年煙粉虱樣本來源及相關(guān)信息

1.2 酶和試劑

PCR試劑盒購自TaKaRa公司;DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;蛋白酶K、RNAase購自天根生化科技(北京)有限公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 DNA的提取

參考滕海媛[18]的方法并略作修改,將其方法中的第1步改為吸20μL裂解液于封口膜上,將1頭煙粉虱置于提取液中,用0.2 mL PCR管底部將煙粉虱充分研磨勻漿,把勻漿液吸入1.5 mL離心管中,再取40μL裂解液清洗封口膜研磨處,將清洗液與勻漿液合并。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳

Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR擴(kuò)增特異性引物[16]分別為5′CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT 3′和 5′CCTTCCCGCAGAAGA-AATTTTGTTC 3′;B型煙粉虱 mtDNA COⅠ基因片段PCR擴(kuò)增特異性引物[16]分別為5′CTAGGGTTTATTGTTTGAGGTCATCATATATTC 3′和 5′AATATCGACGAGGCATTCCCCCT 3′,PCR熱循環(huán)程序[16]為:94℃2 min,94℃30 s,64℃1 min,72℃1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為303 bp和478 bp。煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段 PCR擴(kuò)增通用引物[17]分別為 5′TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT3′和 5′CTGAATATCGAGGCATTCC3′。PCR熱循環(huán)程序[13]為:94℃5 min,94℃1 min,50℃1 min,72℃1 min,共34個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為620 bp。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖(0.5×TBE)電泳檢測,在Biorad凝膠成像儀觀察,記錄結(jié)果。

1.5 序列測定與比較

用B型煙粉虱和Q型煙粉虱的特異性引物擴(kuò)增后的電泳檢測結(jié)果判斷煙粉虱的生物型;對(duì)其中部分樣品應(yīng)用煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段通用引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物回收、純化后送到北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。通過同源性比較,鑒定所采集的煙粉虱種群的生物型。

2 結(jié)果與分析

2.1 Q型和B型煙粉虱特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

使用Q型煙粉虱特異性引物從3個(gè)地區(qū)采集到的煙粉虱中均擴(kuò)增到1條303 bp大小的mtDNA COⅠ基因片段(圖1),應(yīng)用B型煙粉虱的特異性引物可以從本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的B型煙粉虱中擴(kuò)增到1條478 bp大小的mtDNA COⅠ基因片段(圖1)。

圖1 B型和Q型煙粉虱特異性引物對(duì)田間和溫室內(nèi)煙粉虱的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 mtCOⅠ通用引物擴(kuò)增結(jié)果

采用mtCOⅠ通用引物從田間采集的煙粉虱及溫室飼養(yǎng)的B型煙粉虱中均擴(kuò)增到一條大小為620 bp的mtCOⅠ基因片段(圖2)。經(jīng)回收、純化、測序,進(jìn)行相似性比對(duì)后發(fā)現(xiàn),從海淀區(qū)、昌平區(qū)及廊坊市采集到的煙粉虱種群與以色列Q型煙粉虱(登錄號(hào)為AY582869)、美國佛羅里達(dá)州B型煙粉虱(登錄號(hào)為EF080824)的相似性分別為99.85%、98.80%。所以2009年在海淀區(qū)、昌平區(qū)及廊坊市試驗(yàn)基地發(fā)生為害的煙粉虱全部為Q生物型(圖3)。

3 討論

一些學(xué)者利用對(duì)mtDNA COⅠ基因測序和RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)北京部分煙粉虱種群進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)在北京市發(fā)生為害的煙粉虱主要是B型煙粉虱[8-11],本實(shí)驗(yàn)室已有的研究表明在2004年3個(gè)試驗(yàn)基地發(fā)生為害的煙粉虱全部為B型[19],而本研究發(fā)現(xiàn)在北京市海淀區(qū)、昌平區(qū)及河北省廊坊市發(fā)生為害的煙粉虱為Q型,故Q型煙粉虱已經(jīng)取代了B型煙粉虱在這些地區(qū)發(fā)生為害。然而,RAPD標(biāo)記為顯性標(biāo)記不能有效鑒別雜合子,同時(shí)易受反應(yīng)條件的影響,穩(wěn)定性較差;對(duì)mtDNA COⅠ基因測序能夠很好地鑒別煙粉虱生物型,但是這種方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,并且價(jià)格昂貴。在本研究中,聯(lián)合使用B型和Q型煙粉虱mtCOⅠ基因特異性引物能夠快速地鑒別B型與Q型煙粉虱,該結(jié)果與Shatters,Jr等[16]的研究結(jié)論是一致的。因此,對(duì)于局部地區(qū)煙粉虱B型、Q型混合種群,使用這兩個(gè)特異性引物來快速鑒別這2種生物型具有一定的價(jià)值。

B型煙粉虱近20年來迅速入侵世界許多地區(qū),并引起部分入侵地土著煙粉虱種群的下降或滅絕,從而成為最受關(guān)注的一個(gè)生物型[20-21]。而近年來Q型煙粉虱逐漸入侵到B型煙粉虱已經(jīng)建立種群并暴發(fā)的地區(qū),成為繼B型煙粉虱后另一備受關(guān)注的研究對(duì)象。

Nauen等[22]對(duì)采自歐洲不同地區(qū)的煙粉虱種群進(jìn)行了抗藥性研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),西班牙Almeria地區(qū)的Q型煙粉虱對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生了大于100倍的抗性,除了對(duì)新煙堿類藥劑噻蟲嗪、啶蟲脒產(chǎn)生了較高的交互抗性,還對(duì)噻嗪酮、硫丹、久效磷等常用殺蟲劑有交互抗性。另外研究還發(fā)現(xiàn)來自意大利和德國的Q型煙粉虱種群在吡蟲啉、噻蟲嗪和啶蟲脒之間也存在較高的交互抗性;且Q型煙粉虱對(duì)新煙堿類殺蟲劑的抗性更穩(wěn)定,在未施加殺蟲劑選擇壓力的實(shí)驗(yàn)室條件下,Q型煙粉虱對(duì)這類殺蟲劑的抗性在兩年后仍維持在較高水平[22]。Horowitz等[23]的研究發(fā)現(xiàn),以色列地區(qū)的Q型煙粉虱對(duì)昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類農(nóng)藥如吡丙醚產(chǎn)生了很高的抗性。Roditakis等[24]的研究發(fā)現(xiàn),采自地中?？死锾貚u的許多Q型煙粉虱種群都對(duì)吡蟲啉和高效氯氰菊酯產(chǎn)生了高抗性。上述研究結(jié)果表明,Q型煙粉虱對(duì)一些化學(xué)殺蟲劑能夠產(chǎn)生很強(qiáng)且穩(wěn)定的抗藥性以及交互抗性。因此,Q型煙粉虱較B型煙粉虱治理的成本更高、難度更大。

自然條件下Q型煙粉虱競爭取代B型煙粉虱的假說很多。首先,Q型煙粉虱較B型煙粉虱對(duì)于很多種藥劑具有較高的抗藥性被很多學(xué)者認(rèn)同[25],它可能決定了B型煙粉虱和Q型煙粉虱在田間的種群動(dòng)態(tài)和擴(kuò)張趨勢。如Q型煙粉虱在西班牙的自然條件下較B型煙粉虱發(fā)生量大、為害嚴(yán)重,尤其在昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類農(nóng)藥如吡丙醚和新煙堿類農(nóng)藥廣泛使用的地區(qū),B型煙粉虱已基本被Q型取代[25]。研究者推測Q型煙粉虱所具備的高抗藥性可能在其競爭取代B型過程中發(fā)揮了重要作用[25]。蔬菜所的3個(gè)試驗(yàn)基地常年種植蔬菜,藥劑使用歷史較長,尤其在過去十幾年新煙堿類藥劑大量用于防治粉虱類害蟲。短短5年時(shí)間在蔬菜所基地作物上已經(jīng)采集不到B型煙粉虱,并且目前蔬菜所番茄上發(fā)生的Q型煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗性是室內(nèi)飼養(yǎng)B型煙粉虱的819.04倍(未發(fā)表),所以作者推測是因?yàn)镼型煙粉虱較B型煙粉虱對(duì)于很多種藥劑具有高抗性而導(dǎo)致Q型煙粉虱取代B型煙粉虱在蔬菜所基地作物上發(fā)生為害。但是在自然條件下不同地區(qū)煙粉虱生物型的轉(zhuǎn)換與農(nóng)藥的關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究。

其次,Q型煙粉虱較B型煙粉虱在一些雜草和部分農(nóng)作物上具有更強(qiáng)的生物學(xué)優(yōu)勢。比如:在小花錦葵(Malva parvif lora Linn.)、薺[Capsella bursa-pastoris(Linn.)Medic.]、田芥菜[Brassica kaber(DC)]3種不同的雜草上,Q型煙粉虱雌蟲產(chǎn)卵率、化蛹數(shù)、成蟲羽化率等均比B型煙粉虱明顯高[26];在不同品種的番茄上,Q型煙粉虱比B型具有更強(qiáng)的危害性[27];在甜椒上,Q型煙粉虱在17、33℃時(shí)平均世代歷期比B型的要短[27]。另外Q型煙粉虱較B型煙粉虱具有更強(qiáng)忍受極端溫度的能力[28],這也可能是Q型煙粉虱取代B型煙粉虱的一個(gè)重要因素。弄清楚溫度與煙粉虱種群動(dòng)態(tài)之間的關(guān)系對(duì)于改進(jìn)控制策略和評(píng)估它在不同地區(qū)之間的擴(kuò)張能力也是非常重要的。

[1] Brown JK,Czosnek H.Whitefly transmission of plant viruses[J].Advancesin Botanical Research,2002,36:65-100.

[2] Inbar M,Gerling D.Plant-mediated interactions between whiteflies,herbivores,and natural enemies[J].Annual Review of Entomology,2008,53:431-448.

[3] Perring T M.The Bemisia tabaci species complex[J].Crop Protection,2001,20:725-737.

[4] Maruthi M N,Seal S,Colvin J,et al.East Af rican cassava mosaic Zanzibar vir us-a recombinant begomovirus species with a mild phenotype[J].Archives of Virology,2004,149:2365-2377.

[5] Dennehy T J,DeGain B A,Harpold V S,et al.New challenges to management of whitefly resistance to insecticides in Arizona[R].University of Arizona,College of Agriculture Vegetable Rep ort,2005.

[6] Bird T L,Kruger K.Response of the polyphagous whitefly Bemisia tabaci B-biotype(Hemiptera:Aleyrodidae)to crop diversification-influence of multiple sensory stimuli on activity and fecundity[J].Bulletin of Entomological Research,2006,96:15-23.

[7] 張芝利.關(guān)于煙粉虱大發(fā)生的思考[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué),2000(增刊):1-3.

[8] Wu X X,Hu D X,Li Z X,et al.Using RAPD-PCR to distinguish biotypes of Bemisia tabaci(Homoptera:Aleyrodidae)in China[J].Insect Science,2002,9:1-8.

[9] 羅晨,姚遠(yuǎn),王戎疆,等.利用mtDNA COI基因序列鑒定我國煙粉虱的生物型[J].昆蟲學(xué)報(bào),2002,45(6):759-763.

[10]褚棟,張友軍,叢斌,等.煙粉虱不同地理種群的mt DNA COI基因序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(1):76-85.

[11]Zhang L P,Zhang Y J,Zhang W J,et al.Analysis of genetic diversity among different geographical populations and determination of biotypes of Bemisia tabaci in China[J].Journal of Applied Entomology,2005,129:121-128.

[12]褚棟,張友軍,叢斌,等.云南Q型煙粉虱種群的鑒定[J].昆蟲知識(shí),2005,42(1):54-56.

[13]Chu D,Zhang Y J,Brown JK,et al.The introduction of the exotic Q biotype of Bemisia tabaci from the Mediterranean region into China on ornamental crops[J].Florida Entomologist,2006,89:168-174.

[14]徐婧,王文麗,劉樹生.Q型煙粉虱在浙江局部地區(qū)大量發(fā)生危害[J].植物保護(hù),2006,32(4):121.

[15]徐文華,左文惠,王瑞明,等.煙粉虱種群在江蘇沿海城市市區(qū)的寄主分布與蟲源性質(zhì)[J].華東昆蟲學(xué)報(bào),2007,16(3):187-195.

[16]Shatters Jr R G,Powell C A,Boykin L M,et al.Improved DNA barcoding method for Bemisia tabaci and related Aley rodidae:development of universal and Bemisia tabaci biotype-specific mitochondrial cytochrome c oxidase I polymerase chain reaction primers[J].Journal of Economic Entomology,2009,2:750-758.

[17]Simon C,Frati F,Beck enbach A,et al.Evolution,weighting,and phylogenetic utility of mitochond rial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers[J].Annals of the Entomological Society of America,1994,87:651-701.

[18]滕海媛,吳青君,徐寶云,等.SRAP技術(shù)研究煙粉虱遺傳多樣性[J].昆蟲知識(shí),2009,46(1):139-144.

[19]婁蘊(yùn)萍.寄主植物對(duì)B型煙粉虱種群遺傳分化的影響[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,2006.

[20]Liu S S,De Barro P J,Xu J,et al.Asymmetric mating interactionsdrive widespread invasion and displacement in a whitefly[J].Science,2007,318:1769-1772.

[21]Delatte H,Duyck P F,Triboire A,et al.Differential invasion success among biotypes case of Bemisia tabaci[J].Biological Invasions,2009,11:1059-1070.

[22]Nauen R,Stumpf N,Elbert A.Toxicological and mechanistic studies on neonicotinoid cross resistance in Q-type Bemisia tabaci(Hemiptera:Aley rodidae)[J].Pest Management Science,2002,58:868-875.

[23]Horowitz A R,Denholm I,Gorman K,et al.Biotype Q of Bemisia tabaci identified in Israel[J].Phy toparasitica,2003,31:94-98.

[24]Roditakis E,Grispou M,Morou E,et al.Current status of insecticide resistance in Q biotype Bemisia tabaci populations from Crete[J].Pest Management Science,2008,65:313-322.[25]Horowitz A R,Kontsedalov S,Khasdan V,et al.Biotypes B and Q of Bemisia tabaci and their relevance to neonicotinoid and pyriproxyfen resistance[J].Archives of Insect Biochemistry and Physiology,2005,58:216-225.

[26]Nombela G,Beitia F,Muniz M.A differential interaction study of Bemisia tabaci Q-biotype on commercial tomato varieties with or without the mi resistance gene,and comparative host responses with the B-biotype[J].Entomologia Experimentalis et Ap plicata,2001,98:339-344.

[27]Muniz M,Gloria N.Differential variation in development of the B-and Q-biotypesof Bemisiatabaci(Homop tera:Aleyrodidae)on sweet pepper at constant temperatures[J].Environmental Entomology,2001,30:720-727.

[28]Bonato O,Lurette A,Vidal C,et al.Modelling temperaturedependant bionomics of Bemisiatabaci(Q-biotype)[J].Physiological Entomology,2007,32:50-55.