趙延棟,傅曉駿

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州310053;2.金華市中醫(yī)院腎內(nèi)科,浙江 金華321017)

糖尿病腎病(diabetic nephrahy, DN)是糖尿病特有的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥,由于該病起病隱匿,早期常無明顯臨床表現(xiàn), 因此,如能早期診斷、早期治療,對(duì)阻止和延緩DN的發(fā)展有著重要意義。 DN發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,到目前為止尚不能完全闡明。目前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN的發(fā)生及發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果[1]。近年研究表明,血小板衍化生長因子B(PDGF-B)參與了DN的發(fā)生和發(fā)展[2]。本試驗(yàn)通過觀察腎糖顆粒對(duì)糖尿病大鼠血糖、24 h尿蛋白及腎組織PDGF-B表達(dá)的影響,探討其對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康雄性 SD大鼠 70 只, 清潔級(jí), 體質(zhì)量(160±20)g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購并飼養(yǎng),動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):NO.0066490。

1.2 藥物、試劑與儀器

腎糖顆粒由黃芪、水蛭等藥物組成,常規(guī)水煎,醇提,濃縮成顆粒劑,由浙江金華市中醫(yī)院中藥制劑室提供。用時(shí)以蒸餾水溶解,使生藥含量分別為黃芪2 g/mL、水蛭粉0.33 g/mL。鹽酸貝那普利片(商品名稱為洛汀新),劑量為10 mg/片,北京諾華制藥有限公司產(chǎn)品,用時(shí)將1片鹽酸貝那普利片溶于30 mL蒸餾水中。鏈脲佐菌素(STZ),美國Sigma公司產(chǎn)品,批號(hào)S0130;尿蛋白定量試劑盒,購自南京建成生物工程研究所,批號(hào)C035;兔抗鼠PDGF-B多克隆抗體,購自武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào)BA0519;SP免疫組化二抗試劑盒(通用型),購自麥約爾生物技術(shù)有限公司,批號(hào)CatalogNO-HSP0007。LEICA熒光倒置顯微鏡及LEICADFC295圖像采集系統(tǒng),均為LEICA Microsystems Ltd.產(chǎn)品,均由上海中醫(yī)藥大學(xué)腎病研究所提供。

1.3 分組與給藥

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)取8只為正常對(duì)照組,給予普通飼料喂養(yǎng);剩余大鼠給以高脂飼料喂養(yǎng),并腹腔注射STZ建立糖尿病腎病模型。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食、飲水,不使用胰島素及其他降糖藥物。大鼠禁食12 h后(晚7 點(diǎn)到第2 天早上7點(diǎn)),每只大鼠先腹腔內(nèi)注射0.5 mL福氏完全佐劑(CFA), 第2 天再按 25 μg/g體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射STZ,每周1次,連續(xù)3周重復(fù)上述步驟。每周造模第6天測試血糖。正常組腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液作對(duì)照。血糖16.7 mmol/L為糖尿病(DM)造模成功。將DM大鼠在最后一次注射STZ兩周后投入代謝籠收集尿液, 測定點(diǎn)時(shí)尿蛋白/肌酐比率(ACR),造模組和正常對(duì)照組對(duì)比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者予以剔除。將合格的32只大鼠根據(jù)ACR隨機(jī)分為模型對(duì)照組、鹽酸貝那普利片組、腎糖顆粒組、腎糖加鹽酸貝那普利片組4組,每組8只。腎糖顆粒組給予腎糖顆粒灌胃,其中黃芪 0.02 g/g體質(zhì)量、水蛭粉3.3 mg/g體質(zhì)量,相當(dāng)于成人劑量的20倍;鹽酸貝那普利片組給予鹽酸貝那普利片灌胃,3.3 mg/g體質(zhì)量,相當(dāng)于成人劑量的20倍;腎糖加鹽酸貝那普利片組給予此兩種藥物灌胃。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量的蒸餾水, 1次/d,共8周。

1.4 檢測指標(biāo)

灌胃第8周最后1 d代謝籠收集24 h尿, 采用化學(xué)比色法測定24 h尿蛋白。禁食8 h后,稱重、麻醉,無菌條件下腹主動(dòng)脈取血分離提取血清,采用OneTouchUltra血糖儀測血糖(GLU);剖取腎臟,去除包膜后沿矢狀線正中切開,取1/2 腎臟用10%甲醛溶液固定,取小塊皮質(zhì),采用免疫組織化學(xué)方法檢測腎組織PDGF-B表達(dá)。其操作步驟如下:①迅速取出小塊腎皮質(zhì),乙醇逐級(jí)脫水,石蠟包埋,制成4 μm厚的石蠟切片。②切片脫蠟置水, 3% H2O2室溫孵育 5～10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;蒸餾水沖洗, 磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min;置入抗原修復(fù)液,微波爐修復(fù),冷卻。③5%～10%正常山羊血清封閉, 室溫孵育10 min。 ④傾去血清,勿洗;滴加兔抗鼠PDGF-B多克隆抗體 , 4℃過夜;第2天取出,用PBS洗, 5 min×3 次。⑤滴加通用型生物素化二抗, 37 ℃孵育10～30 min;PBS洗,5 min×3次。⑥滴加HRP標(biāo)記鏈親和素, 室溫孵育10～ 30 min;PBS洗, 5 min×3 次。⑦PBS洗后,DAB顯色;自來水充分沖洗;蘇木素復(fù)染, 封片。每張切片在LEICA顯微鏡400倍下 用LEICADFC 295圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)選取10 個(gè)含腎小球的視野,用Image-ProPlus圖像分析軟件測量免疫組化染色的積分光密度值(inter grated optical density, IOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 腎糖顆粒對(duì)DN大鼠24 h尿蛋白、血糖的影響

模型對(duì)照組血糖、24 h尿蛋白升高,與正常對(duì)照組對(duì)比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各治療組的以上兩指標(biāo)降低,與模型對(duì)照組對(duì)比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);腎糖顆粒組以上兩指標(biāo)均低于鹽酸貝那普利片組, 但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的24 h尿蛋白、血糖對(duì)比 ±s

表1 各組大鼠的24 h尿蛋白、血糖對(duì)比 ±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比, ** P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比, ##P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 血糖/mmol·L-1 24 h尿蛋白/mg·24 h-1正常對(duì)照組 8 7.25 ±0.95 13.01±3.72模型對(duì)照組 8 32.38 ±1.26** 91.77±14.33**腎糖顆粒組 8 24.59 ±1.98## 53.41±24.35##鹽酸貝那普利片組 8 26.10 ±3.51## 54.10±22.14##腎糖加鹽酸貝那普利片組 8 23.33 ±5.62## 38.34±14.18##

2.2 腎糖顆粒對(duì)DN大鼠腎組織PDGF-B表達(dá)的影響

正常對(duì)照組大鼠腎組織中PDGF-B免疫組化染色,僅可見極少量的棕色顆粒, 且著色非常淺淡(見圖1)。模型對(duì)照組大鼠腎組織可見明顯的棕褐色顆粒存在(見圖2)。3個(gè)藥物組強(qiáng)度介于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組之間(P＜0.05)(分別見圖3～5),而腎糖加鹽酸貝那普利片組分別低于腎糖顆粒組和鹽酸貝那普利片組,腎糖顆粒組也低于鹽酸貝那普利片組,但差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見圖6)。

3 討 論

DN是糖尿病重要的慢性并發(fā)癥之一, 也是糖尿病患者死亡原因之一,臨床治療的手段和效果相當(dāng)有限, 因此積極尋找有效的藥物治療糖尿病腎病具有重要的意義。高血糖可引起蛋白尿,而蛋白尿是糖尿病腎病的重要臨床表現(xiàn),長期的蛋白尿能引起腎小管上皮細(xì)胞損傷并誘使炎性因子和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,從而直接引起進(jìn)行性腎損傷的病理變化。因此蛋白尿的出現(xiàn)不僅是腎臟損壞的一種標(biāo)志,更是促進(jìn)腎病進(jìn)展的重要因素;治療和預(yù)防糖尿病腎病不僅僅需要控制血糖,有效地控制蛋白尿也尤為重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腎糖顆粒可以明顯降低糖尿病腎病大鼠血糖且能較好地減少尿蛋白的排泄。通過降低血糖,可使毛細(xì)血管數(shù)得以恢復(fù),基底膜增厚得以抑制,從而可改善腎血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。通過對(duì)氧自由基的清除,可使腎小球基底膜損害降低,減少了尿蛋白的丟失,從而阻止了DN的發(fā)生和發(fā)展。

中醫(yī)學(xué)依據(jù)DN臨床表現(xiàn)將其歸屬于“腎消”、“水腫”、“關(guān)格”等范疇。其基本病機(jī)為氣虛血瘀,貫穿于疾病的全病程?；诖?筆者以益氣、活血、化瘀為法組成腎糖顆粒方。方中黃芪性溫,有益氣、補(bǔ)虛、消腫的功效,走而不守,可益氣扶正;水蛭為傳統(tǒng)的破血、逐瘀、通經(jīng)藥,行血、散瘀、通絡(luò)、抗凝,且作用平和、不傷陰血?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí),黃芪益氣健脾,可抗血小板凝集,降低血黏度、改善微循環(huán),降低蛋白尿,從而改善DN患者的高灌注、高濾過狀態(tài);水蛭中的水蛭素抗凝作用是肝素的20倍,且與凝血酶原親和力極強(qiáng),具有減輕氧自由基損傷、抗脂質(zhì)過氧化、改善血脂代謝及增強(qiáng)纖溶活性、抗凝抗血栓作用[3]。兩者合用,可針對(duì)糖尿病腎病的病理基礎(chǔ)進(jìn)行治療,減少尿蛋白的排出,改善腎功能。近年有實(shí)驗(yàn)證明, 糖尿病腎病的病理改變、臨床表現(xiàn)與細(xì)胞因子密切相關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)血小板衍化生長因子(PDGF)可誘發(fā)血管收縮和舒張,刺激系膜細(xì)胞收縮,并通過影響TGF-β、前列腺素而引起系膜細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生和系膜細(xì)胞有絲分裂效應(yīng),使ECM成分如膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘蛋白等的合成作用增強(qiáng),導(dǎo)致ECM聚積、腎小球硬化[4]。本實(shí)驗(yàn)顯示,正常大鼠腎組織中有極少的PDGF-B的表達(dá),而模型對(duì)照組糖尿病大鼠腎組織中PDGF-B的含量明顯增高。這種結(jié)果的可能機(jī)制是:DN早期腎組織改變主要以腎臟系膜細(xì)胞增生為主(后者是分泌PDGF-B的主要細(xì)胞)。另外,高血糖通過激活PKC信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)了PDGF-B的表達(dá),并能顯著提高PDGF-B在單核-巨噬細(xì)胞、腎臟系膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。而筆者的實(shí)驗(yàn)顯示,腎糖顆粒組大鼠腎組織中的PDGF-B的含量明顯比模型對(duì)照組低(P＜0.05),表明腎糖顆?？梢砸种芇DGF-B在糖尿病腎病大鼠腎組織中過度表達(dá)。

綜上所述,腎糖顆粒可通過降低糖尿病腎病大鼠的血糖、24 h尿蛋白來有效改善腎功能,并能明顯下調(diào)細(xì)胞因子PDGF-B的表達(dá)。因此,推測通過抑制PDGF-B在糖尿病腎病大鼠腎組織中過度表達(dá)來減輕腎小球硬化和ECM的沉積是腎糖顆粒保護(hù)糖尿病腎病大鼠腎功能的機(jī)制之一。

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