白小佳，宋慶明，肖萍，王艷萍

（天津市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

堿性蛋白酶水解蠶豆蛋白的條件優(yōu)化

白小佳，宋慶明，肖萍，王艷萍*

（天津市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

采用堿性蛋白酶酶解蠶豆分離蛋白，通過正交試驗確定最佳酶解反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為50℃，pH值為8.5，酶與底物比為16000 U/g，底物濃度為60 g/L。在此條件下，水解度可以達到15.55%。

蠶豆蛋白；酶解；優(yōu)化

近年來多肽越來越受到重視，現(xiàn)代生物學(xué)試驗已經(jīng)證明，多肽與蛋白質(zhì)和氨基酸相比具有更多的優(yōu)點：多肽在腸道中的吸收率最好[1]，一些低肽如二肽、三肽的吸收速度比氨基酸快；一些多肽具有強化機體免疫、促進人體新陳代謝的作用；多肽具有低抗原性、促進脂質(zhì)代謝、降低膽固醇、促進礦物質(zhì)吸收、降血壓、抗氧化、促進微生物生長等生理功能；多肽具有較好的酸、熱穩(wěn)定性、水溶性[2]。這些功能使蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物作為高效氮源受到國際營養(yǎng)界和食品產(chǎn)業(yè)的高度重視。乳蛋白的分解物、大豆蛋白的分解產(chǎn)物、畜血蛋白的分解產(chǎn)物和玉米蛋白的分解產(chǎn)物都已經(jīng)成為運動飲料、功能食品和醫(yī)療食品的重要原料。

蠶豆的蛋白質(zhì)含量高,是我國重要的糧食、蔬菜和副食品。蠶豆的微量元素含量較高,尤其是磷、鎂、硒的含量居常食幾種豆類之首,成熟的蠶豆中B族維生素的含量比其他豆類都高，而未成熟蠶豆則是VA和VC的上等來源。蠶豆種子不僅蛋白質(zhì)含量高。而且蛋白質(zhì)中氨基酸種類全，人體內(nèi)不能合成的8種必需氨基酸中，除色氨酸和蛋氨酸含量稍低外，其余6種含量都高，尤其以賴氨酸含量豐富，比谷物中高出3倍，所以蠶豆被譽為植物蛋白質(zhì)的新來源[3]。因此，許多國家都很重視對蠶豆的研究，并對相應(yīng)發(fā)展起來的蠶豆加工業(yè)也加倍關(guān)注。

本課題組已經(jīng)對蠶豆蛋白的超聲提取工藝進行了研究，取得了較好的效果[4]。本試驗通過對堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的條件進行優(yōu)化，制取蠶豆蛋白水解產(chǎn)物，提高了蠶豆的營養(yǎng)價值，為今后對蠶豆蛋白水解物生物活性的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

蠶豆：購于天津北塘市場。

1.1.2 試劑

堿性蛋白酶：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司（2×105U/g）；其它試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

DELTA-320型pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；78HW-1型恒溫磁力攪拌器：杭州儀表電機廠；VIS-7220型分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：天津市達北實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 蠶豆分離蛋白的制備流程

市售蠶豆，50℃～60℃水溶漲24 h,去皮后,將蠶豆置于55℃烘箱中烘干，所得蠶豆仁用粉碎機粉碎后過60目篩，得到的蠶豆粉置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。?jīng)超聲提取蠶豆粉中蛋白質(zhì)，調(diào)pH至4.2，離心保留沉淀，冷凍干燥24 h，得到蠶豆分離蛋白[4]。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定

凱氏定氮法，參照GB5009.5-1985《食品中蛋白質(zhì)的測定方法》[5]。

1.2.3 水解度（DH）的測定

蛋白水解度（DH）以水解斷裂的肽鍵數(shù)目（h）占總肽鍵數(shù)目（htot）的百分數(shù)來表示，即DH=h/htot×100%，由于pH-stat法[6]具有操作簡單，連續(xù)測定的優(yōu)點，因此主要采用該法來檢測蠶豆分離蛋白的水解度。

蛋白水解度可根據(jù)水解過程中NaOH的消耗量來進行計算，計算公式如下：

式中：B為水解過程中所消耗的NaOH的溶液量，mL；NB為-溶液的當量濃度，（mol/L）；α 為水解時 α-氨基平均解離度，1/α=1+10（pK-pH）；pK 為蛋白質(zhì) α-氨基的pK值；pH為水解溶液的pH值；MP為底物蛋白質(zhì)的總量，g；Htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，Htot取 7.75 mmol/L[7]。

1.2.4 蠶豆分離蛋白的酶解反應(yīng)

準確稱取適量蠶豆分離蛋白于100 mL蒸餾水中混勻，放入集熱式磁力攪拌器中，調(diào)節(jié)溫度、pH值，加入一定量蛋白酶進行水解，通過加入2 mol/L氫氧化鈉來保持pH值不變，記錄堿液消耗量，換算成DH值，反應(yīng)時間 1 h（pH變動范圍 ±0.1），到達時間后，調(diào)節(jié)溶液pH值到4.0，并在85℃水浴中維持20 min，對酶進行滅活，然后迅速冷卻至室溫，在4000 r/min下離心20 min，傾倒出上清液，調(diào)pH到7.0，凍干備用。

記錄NaOH溶液的滴加量，利用公式（1）pH-stat法計算水解度。

1.2.5 溫度對水解反應(yīng)的影響

精確稱取6 g蠶豆分離蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，加入 84000 U 堿性蛋白酶，分別在 40、50、60、70 ℃溫度，pH值為8.0的條件下進行水解反應(yīng)，記錄消耗的氫氧化鈉的體積，研究溫度對水解的影響。

1.2.6 pH對水解反應(yīng)的影響

精確稱取6 g蠶豆分離蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，加入84000 U堿性蛋白酶，反應(yīng)溫度為60℃，分別在 pH 為 8.0、8.5、9.0、10.0的條件下進行水解反應(yīng)，記錄消耗的氫氧化鈉的體積，研究pH對水解的影響。

1.2.7 底物濃度對水解反應(yīng)的影響

分別精確稱取 4、5 、6、7、8、9 g 的蠶豆分離蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，加入84000 U堿性蛋白酶，反應(yīng)溫度為60℃，pH為8.0條件下進行水解反應(yīng)，記錄消耗的氫氧化鈉的體積，研究底物濃度對水解的影響。

1.2.8 酶與底物濃度比對水解反應(yīng)的影響

分別精確稱取6 g蠶豆分離蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，分別加入 60000、72000、84000、96000 U 堿性蛋白酶，使酶與底物濃度比為10000、12000、14000、16000 U/g，反應(yīng)溫度為60℃，pH為8.0條件下進行水解反應(yīng)，記錄消耗的氫氧化鈉的體積，研究酶與底物濃度比對水解的影響。

1.2.9 酶解條件的優(yōu)化

正交試驗[8-9]具有試驗次數(shù)少、代表性強和綜合可比的優(yōu)點。根據(jù)酶解的單因素試驗結(jié)果，選擇溫度、底物濃度、pH值、酶與底物比為正交試驗的因素，擬通過L16（45）正交試驗來確定最佳水解反應(yīng)條件，以DH為指標，確定蠶豆分離蛋白最佳水解工藝參數(shù)，表1為正交試驗因素水平編碼表。

表1 L16（45）正交試驗因素水平設(shè)計表Table1 Factorsandlevelsdesignoforthogonaltest

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆分離蛋白的提取

將蠶豆粉按照1∶12的料液比溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH到8.0，功率660 W下超聲提取20 min，2000 r/min離心5 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH到4.2，沉淀蠶豆蛋白，3500 r/min離心10 min，取沉淀，冷凍干燥24 h，得到蠶豆分離蛋白，此條件下提取的蠶豆分離蛋白中蛋白質(zhì)含量為89.32%。

2.2 反應(yīng)溫度對水解的影響

各種催化反應(yīng)都有最適的溫度，此時，酶的反應(yīng)速度最快。與普通化學(xué)反應(yīng)一致，在酶的最適溫度以下，隨著溫度的升高，反應(yīng)物能量增加，單位時間內(nèi)分子間有效接觸次數(shù)增加，反應(yīng)速度越快。如果反應(yīng)體系溫度超過酶的最適溫度，酶分子吸收了過多的能量，引起維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵解體，導(dǎo)致變性，因而使酶活性減弱甚至喪失催化能力。

圖1可知，在溫度<60℃時，隨溫度升高DH增大；當溫度為60℃時，DH達到最大值；但溫度>60℃時，DH隨溫度增加而降低，因此，本試驗條件下，堿性蛋白酶水解蠶豆分離蛋白的最適溫度60℃。

2.3 反應(yīng)pH對水解的影響

酶分子是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，具有一個或若干個活性部位，酶的活性部位由結(jié)合部位和催化部位組成。結(jié)合部位的功能是直接與底物相結(jié)合，而催化部位則催化底物進行特定的反應(yīng)?；钚圆课恢械幕鶊F在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)所處的位置通常相距較遠，也許可能位于不同的肽鏈上，但是它們在酶的空間結(jié)構(gòu)卻必須按一定的相對位置靠近在一起，形成活化中心（活性部位）。因此酶的活性部位只有在酶蛋白保持一定的空間構(gòu)象時才能存在，并發(fā)揮其催化作用。結(jié)合部位和催化部位的基團對反應(yīng)體系的pH值變化比較敏感，其解離狀態(tài)隨pH的變化而變化，這些變化影響了酶分子的特殊構(gòu)象。另外體系中作為底物的蠶豆分離蛋白隨著pH值變化也表現(xiàn)出不同的解離狀態(tài)，因此，pH值直接影響了酶與底物的結(jié)合和催化，是酶催化反應(yīng)的主要因素之一。反應(yīng)pH對水解的影響見圖2。

由圖2可知，在pH小于8.5時，隨pH升高，DH升高；在pH大于8.5時，隨pH升高而DH降低；而在pH為8.5時，DH達到最大。本反應(yīng)體系下，堿性蛋白酶催化蠶豆分離蛋白水解的最適pH值為8.5。

2.4 底物濃度對水解反應(yīng)的影響

酶與底物反應(yīng)速度在一定程度上取決于底物濃度，由圖3可知，DH隨底物濃度的增大而呈下降趨勢。

底物濃度在不斷受熱情況下，蠶豆蛋白分子易于產(chǎn)生交鏈聚合現(xiàn)象。使酶分子與蛋白分子之間的接觸機會減少，從而導(dǎo)致DH的下降，且溶解性差，黏度增大，影響反應(yīng)速度。但底物濃度過低時，產(chǎn)品的得率和生產(chǎn)效率不高，經(jīng)濟效益差。綜合考慮，選用底物濃度為60 g/L作為最適底物濃度。

2.5 酶與底物濃度比對水解的影響

在底物蠶豆分離蛋白濃度一定時，底物的轉(zhuǎn)化率取決于酶濃度，酶濃度越大，酶與蛋白質(zhì)分子肽鏈接觸幾率增加，底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物可溶性肽也就相應(yīng)地增加。所以高劑量的酶可提高轉(zhuǎn)化率，但酶成本較高，適當添加可降低成本。綜合考慮，水解反應(yīng)速率、蛋白質(zhì)水解度及生產(chǎn)成本之間的相互作用，確定一個最佳酶用量，以達到低成本高效率，同時又能達到目標水解度的要求。酶與底物濃度的對水解的影響見圖4，由圖4結(jié)果可知，隨著酶與底物濃度比的增加，DH增加。但16000 U/g與14000 U/g相比，DH相差不大，酶與底物濃度比無需再增加。

2.6 酶解條件的優(yōu)化分析

按照1.2.9的方法進行正交試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 L16（45）正交試驗設(shè)計表及試驗結(jié)果分析Table2 L16（45）Orthogonalexperimentaldesignandresult

根據(jù)各因子3個水平極差大小得出對水解度影響的主次順序為：溫度>底物濃度>酶與底物濃度比>pH。堿性蛋白酶水解蠶豆分離蛋白的最佳條件為：溫度為50℃，pH值為8.5，酶與底物比為16000 U/g，底物濃度為60 g/L，水解度達到15.55%。

3 結(jié)論

以水解度為指標，使用堿性蛋白酶水解蠶豆分離蛋白，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，做正交試驗得出堿性蛋白酶水解蠶豆分離蛋白的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度為50℃，pH值為8.5，酶與底物比為16000 U/g，底物濃度為60 g/L，水解度達到15.55%?？衫迷撔Q豆蛋白水解物為原料開發(fā)多種產(chǎn)品，具有較好的應(yīng)用前景。

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Optimizing Hydrolysis Conditions of Broad Bean Protein by Alkaline Protease

BAI Xiao-jia,SONG Qing-ming，XIAO Ping,WANG Yan-ping*
（Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Faculty of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

Alkaline protease hydrolysis of broad bean protein was investigated in this research.The result indicated that the hydrolysis degree was 15.55%under the optimized conditions of the hydrolysis temperature 50℃,the solution pH 8.5,enzyme and substrate ratio 16000 U/g,and the substrate concentration 60 g/L.

Broad bean protein;hydrolysis;optimization

白小佳（1975—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通訊作者

2009-09-04