亓玉琴 司君利 李文利 王賀 周長宏 許琳

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院消化科，山東 青島 266011

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤之首，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是其主要原因，因此尋找引發(fā)腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的因素并進行有效阻斷一直是當前研究的熱點和難點［1］。胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多個步驟，其中穿越由細胞外基質(zhì)和基底膜組成的屏障是必不可少的一步。該屏障主要由2種成分構(gòu)成：一是結(jié)構(gòu)蛋白，二是糖氨聚糖，后者的主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulphate proteoglycan，HSPG)。Syndecan-1是HSPG家族的一員，HPA-1基因編碼的蛋白質(zhì)是唯一降解 HSPG硫酸肝素(HS)側(cè)鏈的核苷內(nèi)切酶，并可促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［2］。但有關(guān)Syndecan-1 及HPA-1在胃癌的表達水平及兩者與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮見報道。本研究利用敏感的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR），檢測手術(shù)切除的胃癌組織、配對的癌旁組織（距癌2 cm）及配對遠離癌灶的手術(shù)切緣正常組織（距癌灶大于5 cm）中Syndecan-1及HPA-1基因的表達水平，進一步明確兩者與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標本來源 標本取自青島市立醫(yī)院普外科2008年8月—2009年6月手術(shù)切除的腫瘤組織共58例，標本均經(jīng)病理科2位以上的資深醫(yī)師證實，術(shù)前均未接受任何化療或放療，且均進行了局部淋巴結(jié)的清掃。58例標本均為原發(fā)性胃癌，并配對癌旁組織（距癌邊緣2 cm）及配對手術(shù)切緣正常組織（距癌邊緣5 cm以上），手術(shù)切除的標本立即放于-70 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆糜趯崟r熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）。

1.2 臨床資料 58例胃癌患者中男性33例，女性25例；年齡23～71歲，平均年齡52歲；腫瘤直徑＜5 cm者26例，直徑＞5 cm者32例；中、高分化腺癌10例，低分化及未分化腺癌48例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者3例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者55例；無血行轉(zhuǎn)移者9例，有血行轉(zhuǎn)移者49例；浸潤深度T1/T2者3例，T3/T4者55例；胃癌患者的臨床分期按國際抗癌聯(lián)盟新TNM分期：Ⅰ期、Ⅱ期8例，Ⅲ期、Ⅳ期50例。

1.3 主要試劑和儀器 Simply P 總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）；RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）。定量PCR（Rotor-gene 3000 Real-Time PCR System）。

1.4 熒光定量PCR檢測Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA

1.4.1 RNA提取 嚴格按照Simply P總RNA提取試劑盒的說明進行RNA提取。所得RNA A260nm/A280nm＞1.7，符合純度要求。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增 提取的總RNA按照大連寶生物工程有限公司（TaKaRa公司）RT-PCR反應(yīng)試劑盒的說明進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。HPA-1的引物：上游為5’- CCTTGCCACCTTTAATGGAA-3’，下游為5’-AAGCAGCAACTTTGGCATTT-3’，擴增產(chǎn)物的長度為105 bp；Syndecan-1引物：上游為5’-GGGACTCAGCCTTCAGACAG-3’，下游為5’-CTCGTCAATTTCCAGGAGGA-3’，擴增產(chǎn)物的長度為128 bp； 內(nèi)參的引物：上游為5’-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3’，下游為5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’，擴增產(chǎn)物的長度為146 bp。PCR反應(yīng)體系中含SYBR Premix Ex TaqTM10μL，上下游引物各0.8 μL，模板cDNA2 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR反應(yīng)的條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。實時連續(xù)測定擴增過程中產(chǎn)生的熒光，建立標準曲線。同時取擴增產(chǎn)物4 μL，2%瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙錠進行染色，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.4.3 結(jié)果判斷 目的基因表達陽性的標本熒光定量擴增曲線呈現(xiàn)S型，電泳圖見特異性條帶；陰性標本則成不規(guī)則波浪線，未見特異性條帶?！鰿t=樣本Ct均值-內(nèi)參照Ct均值，△△Ct=△Ct-（隨機陰性對照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參照Ct均值），以2-△△Ct表示樣品中目的基因mRNA相對表達量。樣品中Ct均值＜30表示為目的基因陽性表達。

1.5 統(tǒng)計處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，組間計量資料的比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。Syndecan-1和HPA-1在胃癌組織中表達的相關(guān)性用Spearman進行相關(guān)性檢驗分析。P＜0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同胃組織中HPA-1及Syndecan-1的表達 胃癌組織HPA mRNA陽性表達有50例，陽性表達率為86.2%（50/58），明顯高于癌旁組織27.6%（16/58）和正常組織5.2% (3/58)(P均＜0.001），癌旁組明顯高于正常組織（P均＜0.05）（表1及表2）。正常組織Syndecan-1 mRNA陽性表達率有57例，陽性表達率為98.3%（57/58），明顯高于癌旁組織25.9%(15/58)和胃癌組5.2%(3/58)（P均＜0.001），癌旁胃組織明顯高于胃癌組（P均＜0.05）（表1及表2）。不同胃癌組織中，HPA-1 mRNA和Syndecan-1擴增曲線呈典型的S型（圖1），融解曲線為單峰，排除非特異性擴增及引物二聚體的出現(xiàn)（圖2）。電泳圖可見特異性條帶（圖3）。

表1 HPA-1 mRNA及Syndecan-1 mRNA在不同胃組織中的表達 Tab.1 The expression of HPA-1 mRNA and Syndecan-1 mRNA in various gastric tissues

表2 不同胃組織中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表達Tab.2 Comparison of the expression of HPA-1 mRNA and Syndecan-1 mRNA in various gastric tissues(±s , 2△△Ct)

表2 不同胃組織中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表達Tab.2 Comparison of the expression of HPA-1 mRNA and Syndecan-1 mRNA in various gastric tissues(±s , 2△△Ct)

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圖1 胃癌組織中HPA-1 mRNA熒光定量擴增曲線Fig.1 The amplification curves of HPA-1mRNA acquired from real-time PCR analysis in gastric carcinomas

圖2 胃癌組織中HPA-1 mRNA熒光定量融解曲線Fig.2 The melt curves of HPA-1 mRNA acquired from real-time PCR analysis in gastric carcinoma

圖3 不同胃組織中Syndecan-1和HPA-1PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Agarosegel electrophoresis of the sydencan-1 and HPA-1 PCR production in various gastric tissues

2.2 胃癌HPA-1 mRNA及Syndecan-1 mRNA的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 本研究中通過RT-PCR顯示，胃癌中HPA-1及Syndecan-1的陽性表達率（表3）。低分化及未分化者（93.8%和2.1%）、侵至漿膜外者（93.5%和0）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（89.1%和1.8%）、有血行轉(zhuǎn)移者（91.8%和2.0%）、臨床分期Ⅲ/Ⅳ期者（94.0%和2.0%）明顯高于高中分化者（50.0%和20.0%）、侵至漿膜者（58.3%和25.0%）、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（33.3%和66.7%）、無血行轉(zhuǎn)移者（55.6%和22.2%）及臨床分期Ⅰ/Ⅱ期者（37.5%和25%）（P均＜0.05）。

2.3 Syndecan-1和HPA-1在胃癌組織中表達的相關(guān)性 相關(guān)性檢驗結(jié)果表明，在胃癌組織中，Syndecan-1表達與HPA-1表達呈負相關(guān)（r=-0.415，P=0.006）。

3 討 論

Syndecan-1是一種跨膜硫酸乙酰肝素糖蛋白聚糖，主要由上皮細胞表達，亦可表達于成纖維細胞和漿細胞中，是細胞間質(zhì)、細胞質(zhì)膜的重要組成成分。Syndecan-1通過促進細胞-基質(zhì)和細胞-細胞黏附來阻止細胞脫落和侵襲，從而限制了腫瘤的惡性表型。當正常細胞惡變后，細胞膜表面的Syndecan-1表達常明顯下降或缺失，這可能導(dǎo)致了細胞喪失生長接觸抑制的功能，使腫瘤細胞大量增殖，并具有極強的侵襲活性和轉(zhuǎn)移潛能。有研究發(fā)現(xiàn)，Syndecan-1在人類多種惡性腫瘤中表達降低［3-4］。Syndecan-1在胃異型增生組織中的表達呈下降趨勢，在胃癌組織中的表達減弱或者丟失，提示Syndecan-1在胃癌的發(fā)生過程中可能起重要的作用［5-6］。為此，本實驗利用實時熒光定量PCR對Syndecan-1在基因水平進行了定量檢測。研究結(jié)果顯示：胃正常黏膜組織中Syndecan-1 mRNA幾乎均呈陽性表達，陽性表達率98.3%，配對癌旁組織（距癌邊緣2 cm）陽性表達（25.9%）較配對遠離胃癌的手術(shù)切緣正常胃組織（距癌灶大于5 cm）明顯降低（P＜0.001），原發(fā)性胃癌幾乎未見表達（6.9%），這與Fujiya等［7］關(guān)于大腸腺瘤進展到癌及浸潤癌Syndecan-1異常表達的研究結(jié)果一致。在腫瘤分化程度較高、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期Ⅲ-Ⅳ的胃癌組織中Syndecan-1表達水平降低，隨著胃癌浸潤深度的增加，Syndecan-1的表達水平逐漸下降。目前的研究認為，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期，是胃癌的獨立預(yù)后指標［8］，Syndecan-1 mRNA的表達與這些因素相關(guān)，可能意味著Syndecan-1的表達減少可促進惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。已有研究表明，Syndecan-1與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9-10］。Qi等［11］利用免疫組織化學(xué)證明了Syndecan-1在胃癌癌前的各個階段幾乎均有表達，隨著胃黏膜組織由癌前狀態(tài)發(fā)展為胃癌，Syndecan-1黏附蛋白表達顯著下降，出現(xiàn)遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時Syndecan-1表達更明顯下調(diào)，陽性率降至24.56%。進一步研究證明，當正常細胞惡變后，細胞膜表面的Syndecan-1分子的表達常發(fā)生改變，并且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后有一定的相關(guān)性。在頭頸部鱗狀細胞癌患者中，Syndecan-1表達越高者，生存時間越長。Syndecan-1降低的胃癌患者，5年生存率顯著低于高表達者，提示該基因的表達異常有可能成為估計預(yù)后的較好指標。綜上所述，Syndecan-1可能成為腫瘤基因治療的分子靶點，并可能成為腫瘤診斷、病情進展和預(yù)后判斷的重要指標。

表3 胃癌HPA-1及Syndecan-1表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Correlation of HPA-1 and Syndecan-1 expression with clinic pathological features in gastric carcinoma

HPA-1是一種新近被克隆出來的基因，它編碼的蛋白質(zhì)被認為是一種降解細胞表面跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate protoglycan，HSPG）的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）側(cè)鏈的核苷內(nèi)切酶。HPA-1在惡性組織中普遍存在，在正常組織細胞的表達水平較低。在早期的研究中發(fā)現(xiàn)，其主要表達于胎盤和一些淋巴樣組織中，而這些組織中的細胞具有較強的增殖和穿透基底膜進行遷移的能力。HPA-1通過特異性地識別并切斷HSPGs中的HS側(cè)鏈，進而影響有機體的微環(huán)境，在妊娠、形態(tài)發(fā)育、炎癥擴散、血管生成，特別是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。Endo［12］分析表明HPA-1的表達與胃癌的侵襲發(fā)展密切相關(guān)。毛敬等［13］通過基因轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細胞實驗證實，轉(zhuǎn)染HPA基因能促進卵巢癌細胞的生長增殖，增強卵巢癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。說明HPA可能在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本實驗利用實時熒光定量PCR對HPA-1 mRNA進行定量檢測，結(jié)果顯示：胃癌（86.2%）明顯高于癌旁胃黏膜（27.6%）（P＜0.001）和正常胃黏膜（5.2%）（P＜0.001），癌旁胃黏膜明顯高于正常胃黏膜（P＜0.05）。與Kurokawa等［14］的研究結(jié)果相符。在胃癌組織中，HPA-1 mRNA的表達與反應(yīng)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后的組織病理學(xué)指標呈正相關(guān)，與陳俊強等［15］的研究結(jié)果相符?？梢?，HPA-1參與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，并且隨著腫瘤浸潤深度和惡性程度的增加，HPA-1 mRNA的表達逐漸增加。Ru等［16］的研究表明，HPA-1陰性表達組5年生存率明顯高于陽性組，提示其與胃癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。已有許多學(xué)者將HPA-1作為抗腫瘤治療的靶點，為腫瘤的診斷，治療和判斷預(yù)后提供了新的思路和方法。

本研究利用熒光定量PCR對Syndecan-1和HPA-1在基因水平進行聯(lián)合定量檢測，較免疫組織化學(xué)及普通RT-PCR敏感性強、特異性高，且關(guān)于兩者蛋白質(zhì)水平檢測，國內(nèi)外已有大量的報道［7，11，15］。本研究結(jié)果表明，Syndecan-1的低表達及HPA-1的高表達可促進胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，兩者對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有協(xié)同作用。本實驗在胃癌組織中對兩者進行相關(guān)性檢驗，發(fā)現(xiàn)兩者成負相關(guān)（r=-0.415），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此聯(lián)合檢測Syndecan-1和HPA-1有助于胃癌患者的診斷及胃癌的轉(zhuǎn)移潛能、預(yù)后的判斷。對于Syndecan-1表達陰性和HPA-1表達強陽性的胃癌患者術(shù)后應(yīng)加強綜合治療，密切隨訪。

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