張潛 王洪林

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，重慶 400016

胰腺癌是一種臨床表現(xiàn)隱匿、進(jìn)展迅速、早期診斷困難、手術(shù)切除率低、預(yù)后不良的惡性消化道腫瘤。吉西他濱（gemcitabine，GEM）已經(jīng)成為進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性胰腺癌標(biāo)準(zhǔn)的一線化療藥物，并已逐漸成為進(jìn)展期胰腺癌標(biāo)準(zhǔn)化療方案用藥，雖已具有很明顯的臨床獲益，但生存優(yōu)勢(shì)卻很低［1-2］。其原因是藥物使用過程中的耐藥現(xiàn)象影響其療效［3］。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是細(xì)胞內(nèi)一類重要的凋亡抑制因子家族，包括X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）、神經(jīng)元凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitory protein， NIAP）、生存素（survivin）和黑色素瘤IAP（ML-IAP，livin）等。有研究［4］指出，XIAP是IAPs家族中最有效的內(nèi)源性caspases抑制因子。也有研究［5］顯示，XIAP在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并與腫瘤的化療抵抗相關(guān)。國內(nèi)對(duì)應(yīng)用GEM作用胰腺癌后，對(duì)XIAP這一重要凋亡相關(guān)蛋白的影響研究尚少，本研究旨在探討GEM誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞中XIAP的表達(dá)及其與化療耐藥可能的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

1.1.1 細(xì)胞株 胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 試劑 GEM（法國禮來公司），RT試劑盒（TAKARA公司），XIAP引物（TAKARA公司合成），兔抗人XIAP抗體、兔抗人β-actin抗體和羊抗兔IgG抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司分裝）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 用0.25%的胰酶+0.02% EDTA的消化液消化BxPC-3細(xì)胞，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每2～3 d按1∶3傳代2次。

1.2.2 B x P C-3 細(xì)胞對(duì)G E M 的中效濃度（IC50）的測(cè)定 ⑴細(xì)胞以1×104/孔接種于含200 μL上述培養(yǎng)液的96孔板中，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑵在各孔中加入最終濃度分別為1、2.5、5、10、20和40 μg/mL的GEM 20 μL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以不加藥物細(xì)胞存活率為100%的孔和沒有接種細(xì)胞的試劑孔分別作為細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照。⑶細(xì)胞在濃度梯度藥物作用下分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，每孔加入5 mg/mL噻唑藍(lán)（MTT）溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。⑷吸干培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜液200 μL，室溫?fù)u床振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。⑸在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長測(cè)各孔吸光度值。⑹細(xì)胞增殖存活率（%）=［（A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組）/（A細(xì)胞對(duì)照組－A空白對(duì)照組）］×100%，根據(jù)IC50計(jì)算軟件得出24 h和48 h的IC50。

1.2.3 GEM對(duì)BxPC-3胰腺癌細(xì)胞內(nèi)XIAP的誘導(dǎo) 細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，取1×106/瓶傳代接種于2個(gè)裝有培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入3.10 μg/mL GEM繼續(xù)培養(yǎng)，未加入GEM的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及早期細(xì)胞凋亡 消化各組細(xì)胞至單細(xì)胞懸液狀態(tài)，300×g離心3 min去上清液后PBS清洗再離心，重復(fù)3次，70%乙醇固定4 ℃保存，以100 mg/L的碘化丙啶溶液染色后在FACSVantage SE流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)XIAP mRNA的表達(dá) ⑴細(xì)胞總RNA的提?。簩?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)后各取1×106于EP管中，用TRIzol法提取細(xì)胞并消化總RNA，將RNA溶于25 μL DEPC水，取5 μL RNA以80 V電壓下行1%瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)稀釋60倍分別測(cè)定260 nm和280 nm的吸光度值，檢驗(yàn)純度，以公式：RNA濃度（μg/mL）=A260nm×稀釋倍數(shù)×40計(jì)算RNA濃度，立即行RT-PCR反應(yīng)。⑵RT-PCR反應(yīng)：RT反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL，PrimeScriptTMRTEnzymeMixⅠ 0.5 μL，Oligo dT Primer（50 μmol/L） 0.5 μL，Random 6 mers（100 μmol/L） 2 μL，總RNA 4.5 μL，RNaseFree dH2O加至10 μL。RT反應(yīng)條件：37 ℃15 min，85 ℃ 5 s。XIAP引物序列為：5’-CAAGTGGTAGTCCTGTTTCAGC-3’（上游），5’-GGGTTAGGTGAGCATAGTCTGG-3’（下游），擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為432 bp，內(nèi)參為β-actin，序列為5’-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3’（上游），5’-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3’（下游），擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為272 bp。PCR反應(yīng)體系為：Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL，10×PCRBuffer (Mg2+Free) 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，dNTPMix (各2.5 mmol/L)4 μL，上游引物(20 μmol/L)1 μL，下游引物(20 μmol/L)1 μL，滅菌蒸餾水加至 50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s（30個(gè)循環(huán)），72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反應(yīng)完畢后，取產(chǎn)物5 μL以1%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠電泳成像儀成像，Quantity one分析各條帶吸光度值，計(jì)算XIAP的mRNA相對(duì)值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)XIAP蛋白的表達(dá) RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取樣本20 μg上樣進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS封閉1 h（4 ℃過夜）。分別加入兔抗人XIAP抗體及兔抗人β-actin抗體于4 ℃溫育過夜，加入1∶1000 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)顯影，凝膠成像測(cè)灰度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，MTT結(jié)果采用多因素方差分析。流式分析，RT-PCR及Western blot檢測(cè)采用單因素方差分析。多個(gè)樣本間的多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GEM對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖影響 MTT法顯示GEM具有顯著抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖的作用，且隨著作用時(shí)間增加及GEM濃度增加，呈明顯的時(shí)間依賴性和濃度依賴性；不同濃度組間、不同時(shí)間組間的細(xì)胞存活率均有顯著性差異（F=15.36，P＜0.05，表1）。

2.2 胰腺癌BxPC-3細(xì)胞對(duì)化療藥物GEM的中效濃度（IC50） MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，GEM對(duì)BxPC-3細(xì)胞24及48 h時(shí)的IC50分別為1.05 μg/mL和3.10 μg/mL，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為3.10 μg/mL的GEM培養(yǎng)24、36、48和72 h作為實(shí)驗(yàn)組，以不含GEM培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。

表1 GEM作用后BxPC-3細(xì)胞存活率Tab.1 The survival rate of BxPC-3 cells treated with different concentrations of GEM(%)

2.3 細(xì)胞周期分析及凋亡檢測(cè) 流式細(xì)胞儀分析顯示，3.10 μg/mL GEM作用24、36、48和72 h后，細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，S期細(xì)胞比例降低。凋亡細(xì)胞比例隨作用時(shí)間延長而增加，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞分別增至（47.5±2.1）%、（53.6±1.4）%、（57.2±2.0）%和（62.3±1.6）%，與對(duì)照組（2 7.6±1.3）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組BxPC-3細(xì)胞凋亡率較低，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率分別增加至（10.3±1.8）%、（14.2±1.5）%、（18.8±1.7）%和（20.3±2.0）%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組（1.23±1.6）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=146.24，P＜0.05）；24 h與36 h組間、36 h組與48 h組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；48 h與72 h組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

2.4 GEM作用胰腺癌BxPC-3細(xì)胞后XIAP mRNA的轉(zhuǎn)錄情況 以β-actin灰度為內(nèi)參照，比較β-actin與目的基因XIAP條帶灰度比值。3.10 μg/mL GEM分別作用24、36、48和72 h后，各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組上升分別為（1.05±0.03）倍，（1.07±0.01）倍，（1.12±0.01）倍和（1.43±0.02）倍，隨作用時(shí)間增加而增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=83.72，P＜0.05）；提示XIAP mRNA的轉(zhuǎn)錄具有時(shí)間依賴性；24 h與36 h組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），36 h組與48 h組間、48 h與72 h組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)及周期分析Fig.1 Detection of cell apoptosis and analysis of cell cycle

圖2 3.10 μg/mL GEM作用不同時(shí)間后BxPC-3細(xì)胞XIAP mRNA的轉(zhuǎn)錄Fig.2 The transcription of XIAP mRNA in the BxPC-3 cells treated with GEM at 3.10 μg/mL for variant sections

2.5 XIAP蛋白的表達(dá) 以β-actin的灰度為內(nèi)參照，比較β-actin與目的基因XIAP條帶灰度比值。3.10 μg/mL GEM分別作用24、36、48和7 2 h 后，各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組上升分別為（1.82±0.13）倍，（2.04±0.18）倍，（2.60±0.12）倍和（3.95±0.06）倍，隨作用時(shí)間增加而增加，不同時(shí)間組間存在顯著性差異，提示XIAP的表達(dá)具有時(shí)間依賴性（F=103.58，P＜0.05）；24 h與36 h組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），36 h組與48 h組間、48 h與72 h組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 3.10 μg/mL GEM作用不同時(shí)間后BxPC-3細(xì)胞XIAP表達(dá)Fig.3 The expression of XIAP in the BxPC-3 cells treated with GEM at 3.10 μg/mL for variant sections

3 討 論

IAPs表達(dá)上調(diào)是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的一個(gè)共同特征，XIAP作為IAPs家族中備受重視的成員，在包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中均呈高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性相關(guān)［6-7］。Shrikhande等［8］研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者的XIAP mRNA水平是對(duì)照組的2.1倍，分析發(fā)現(xiàn)胰腺癌低生存率的患者有較高的XIAP mRNA水平的趨勢(shì)，通過靶向XIAP的SiRNA使Capan-1和T3M4兩種胰腺癌細(xì)胞增殖降低，兩細(xì)胞系對(duì)GEM敏感性都得以增加。杜冀暉等［9］通過轉(zhuǎn)染胞質(zhì)表達(dá)型Smac基因至化療抵抗Panc-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)明顯下調(diào)其XIAP表達(dá)，顯著提高順鉑、5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，得出胰腺癌細(xì)胞XIAP的表達(dá)水平下調(diào)與其化療敏感性有關(guān)的結(jié)論，認(rèn)為XIAP是克服化療抵抗的重要靶分子，而上調(diào)Smac可拮抗XIAP的凋亡抑制作用，協(xié)同化療藥物促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡。Mcmanus等［10］和Lima等［11］均通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)阻斷了XIAP后增強(qiáng)了癌細(xì)胞的化療敏感性。

GEM是細(xì)胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，可阻止細(xì)胞由G1期向S期的進(jìn)展。GEM在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成吉西他濱磷酸鹽，后者可使DNA鏈合成停止，進(jìn)而DNA斷裂、細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮抗癌作用。

本研究結(jié)果表明，GEM具有顯著抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞增殖的作用，且呈明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。GEM對(duì)BxPC-3細(xì)胞的24 h及48 h的IC50分別為1.05 μg/mL和3.10 μg/mL，表明細(xì)胞對(duì)GEM的敏感性隨時(shí)間的增加而降低。3.10 μg/mL GEM作用胰腺癌BxPC-3細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀分析表明：細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并發(fā)生凋亡，且凋亡細(xì)胞比例隨作用時(shí)間的延長而增加，24 h組和36 h組間、36 h組和48 h組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在48 h組和72 h組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明胰腺癌BxPC-3細(xì)胞對(duì)GEM有藥物抵抗性，并且藥物抵抗性在用藥約48 h左右能夠表現(xiàn)出來。RT-PCR及Western blot結(jié)果表明，XIAP mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)都隨著GEM作用時(shí)間增加而增加，在24 h組和36 h組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在36 h組和48 h組間、48 h組和72 h組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明GEM能誘導(dǎo)XIAP的增加，呈時(shí)間依賴性，XIAP表達(dá)增加可能是胰腺癌BxPC-3細(xì)胞對(duì)GEM抵抗性的表現(xiàn)之一。增加的XIAP可能參與并影響了GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，在凋亡執(zhí)行過程中XIAP增加使凋亡受阻，進(jìn)而促進(jìn)化療耐藥得以實(shí)現(xiàn)。

本研究主要探討了GEM對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的作用，GEM能使細(xì)胞凋亡，但隨著作用時(shí)間的延長，其對(duì)藥物的敏感性減低；XIAP這一凋亡抑制蛋白家族重要成員的表達(dá)隨作用時(shí)間延長而增加，XIAP表達(dá)增加可能是胰腺癌細(xì)胞逃避化療藥物殺傷的機(jī)制之一，可能參與了BxPC-3對(duì)GEM的耐藥性的產(chǎn)生，對(duì)后續(xù)針對(duì)靶向凋亡抑制因子XIAP的抗胰腺癌研究有重要意義。

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