趙曉艷 胡玉娜 康向東 張隆 季青 倪振華

上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院中心實驗室，上海200062

胃癌是起病隱匿、發(fā)展迅速的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居癌癥之首，死亡率占癌癥的23.03%［1］。既往研究認為，腫瘤生長迅速的原因是由于癌細胞增殖快、周期短及失去控制，但近年研究發(fā)現(xiàn)是由于癌細胞無限制增殖及凋亡相對或絕對減少所致［2］。因此，針對這些機制的抗癌藥物研發(fā)越來越受到國內(nèi)外研究者的重視，尤其是中草藥及其提取物的研究。熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸、烏蘇酸，屬于三萜類化合物，廣泛存在于夏枯草、連翹、梔子和白花蛇舌草等清熱解毒中草藥中，具有抗炎、保肝、降血脂等多種生物學活性，于1990年被日本列為最有希望的癌化學預防藥物之一［3］。UA抗腫瘤作用已有較多報道，但具體作用機制尚未見報道，本實驗擬探討UA對人胃癌細胞周期和凋亡的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 胃癌細胞株 BGC823細胞株來自上海市普陀醫(yī)院中心實驗室，在含10%滅活PAA小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)傳代，選取對數(shù)生長期細胞用于實驗研究。

1.1.2 主要試劑 UA（Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；小牛血清（微科生物公司）；細胞周期與凋亡檢測試劑盒（南京凱基公司）；680型酶標儀、凝膠成像儀、電泳儀（均為美國Bio-Rad公司）；流式細胞儀（Becton Dickison公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT比色法測BGC823細胞的生長抑制率 取對數(shù)生長期細胞，制成1×108/L的懸液，按每孔200 μL接種于3塊96孔培養(yǎng)板。24 h后加藥，實驗設(shè)空白對照組和陰性對照組及5種不同濃度藥物組，終濃度分別為：20、40、50、60、70 μmol/L，每一濃度設(shè)8個復孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h，加MTT 50μg/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加DMSO 200 μL/孔，酶標儀上機檢測（震蕩10 min，測單波長570nm處吸光值），實驗重復3次。按（A陰性對照組-A加藥組）/（A陰性對照組-A空白對照組）計算藥物對細胞的生長抑制率及IC50值。

1.2.2 流式細胞術(shù)法檢測BGC823細胞的生長周期及凋亡情況 取對數(shù)生長期細胞3 mL按200萬/孔種于6孔板，24 h后依據(jù)上述IC50值分組加藥，即陰性對照組（0 μmol/L）和加藥組（20、40、80 μmol/L），每組3個復孔；分別繼續(xù)培養(yǎng)24后，收集細胞，依照凱基細胞周期及凋亡檢測試劑盒操作步驟進行，最終每個樣品收集10 000個細胞，上流式細胞儀檢測。試驗重復3次，CellQuest軟件進行分析，測定DNA含量和亞二倍體峰在細胞周期所占百分比。

1.2.3 Real time-PCR法檢測BGC823細胞bax、bcl-2 mRNA水平 接板加藥同上，24 h后Trizol法提取細胞總RNA，A260nm/A280nm處測定其濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。以oligodT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，存于-80 ℃?zhèn)溆?。引物和探針由上海生工合成，其序列見?，內(nèi)參采用GAPDH。Real time-PCR反應體系為25 μL：cDNA2 μL，上下游引物各1 μL，探針各1 μL，Taq酶0.5 μL，buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Mg2+2 μL，雙蒸水13 μL。反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s 40個循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 UA對BGC823細胞的生長抑制作用 MTT測定結(jié)果表明UA呈時間-劑量依賴性抑制BGC823細胞增殖，24、48和72 h時IC50分別為36.88、34.72及32.18μmol/L（圖1）。

2.2 UA對BGC823細胞周期及凋亡的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示UA能誘導細胞凋亡，凋亡百分比依次為2.68%、7.79%、11.22%和19.85%；同時UA也影響細胞周期，將細胞阻滯于G2/M期，G2期所占比例依次為5.20%、5.40%、8.05%及17.83%（圖2）。

2.3 對BGC823細胞bax及bcl-2 mRNA表達的影響 結(jié)果顯示UA作用于BGC823細胞后，可呈劑量依賴性的上調(diào)bax及下調(diào)bcl-2 mRNA表達（圖3、4）。

表1 引物和探針序列Tab.1 Sequence of primer and probe

圖1 UA對BGC823細胞生長抑制作用Fig.1 The cell proliferation inhibition rate of BGC823

3 討 論

UA主要來源于白花蛇舌草、夏枯草、連翹和梔子等清熱解毒藥，現(xiàn)代藥理研究證實，清熱解毒藥普遍具有增強機體天然免疫力、抑制特異性免疫反應的作用，臨床上被廣泛應用于癌癥配伍治療。單體UA屬于α-香樹脂醇（α-amyrin）型五環(huán)三萜類化合物，具有廣泛的生物學活性，于1990年被日本列為最有希望的癌化學預防藥物之一［3］。

MTT結(jié)果表明UA呈時間-劑量依賴性抑制BGC823細胞增殖，而流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，UA可誘導BGC823細胞凋亡，并阻滯細胞于G2/M期。細胞在G1期進入S期，G2期進入M期處有控制點，若細胞DNA出現(xiàn)異常即被阻滯。而正常細胞DNA輕度損害時可通過內(nèi)切酶等修復并進入下一周期，癌細胞則缺乏這種調(diào)控［4］。因此，UA將BGC823細胞阻滯于G2/M期，通過影響腫瘤細胞周期來抑制其增殖。

bcl-2和bax同屬bcl-2家族，可調(diào)節(jié)細胞凋亡，但作用相反。bcl-2是特異性抑制細胞凋亡基因，在腫瘤患者中高表達。體外實驗證實，多種因素可對bcl-2高表達進行抑制和阻斷，促發(fā)細胞凋亡，明顯延長腫瘤患者的生存時間［5-6］。bax的生物學作用則是拮抗bcl-2，促進細胞凋亡，兩者表達水平高低與直接調(diào)控凋亡有關(guān)［7］。Real time-PCR結(jié)果顯示，UA作用于BGC823細胞，可上調(diào)其bax mRNA表達，下調(diào)bcl-2 mRNA表達，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。

圖2 UA作用24 h對BGC823細胞周期和凋亡影響Fig.2 Effect of UA on the rate of cell apoptosis and cycle of BGC823 cell tested by Facs

圖3 UA對BGC823細胞bax mRNA表達的影響Fig.3 Expression of bax mRNA in BGC823 cell treated by UA

圖4 UA對BGC823細胞bcl-2 mRNA表達的影響Fig.4 Expression of bcl-2 mRNA in BGC823 cell treated by UA

本實驗觀察到UA呈時間-劑量依賴性抑制BGC823細胞增殖，并能誘導細胞凋亡，將細胞阻滯于G2/M期，其誘導凋亡的機制可能與上調(diào)bax mRNA表達及下調(diào)bcl-2 mRNA表達有關(guān)。但其藥理作用的具體信號通路我們正在進行進一步的研究。

［1］達煒.胃癌靶向治療藥物研究進展［J］.世界臨床藥物, 2007, 729(12): 729-734.

［2］Rvla JK, Lee WJ, Lee KH, et al.SK-7041, a new histone deacetylase inhibitor, induces G2-M cell cycle arrest and apoptosis in pancreatic cancer cell lines［J］.Cancer Lett, 2006, 237(1): 143-154.

［3］Muto Y, Ninomya M, Fuiki H.Present status of research on cancer chemoprevention in Japan［J］.Jpn J Clin Oncol, 1990, 20(3): 219-220.

［4］Luo JZ, Luo L.Ameircan ginseng stimulates insulin production and prevents apoptosis through regulation of uncoupling protein-2 in culture beta cells［J］.Evid Based Complement Alternat Med, 2006, 3(3): 365-372.

［5］Makinen K, Loimus S, Haklaa T, et al.Tumour suppressor protein (p53), apoptosis inhibiting protein (bcl-2) and proliferating cell nuclear antigen expressions in a rat pancreatic tumour model［J］.Anticancer Res, 2007, 27(1A): 23-26.

［6］Ahsan H, Reagna S, Breur J, et al.Snaguinarine induces apoptosis of human pancreatic carcinoma AsPC-1 and BxPC-3 cells via modulations in Bc1-2 family proteins［J］.Cancer Lett, 2007, 249(2): 198-208.

［7］Hou Q, Cymbalyuk E, Hsu SC, et a1.Apoptosis modulatory activities of transiently expressed Bcl-2: roles in cytochrome C release and Bax regulation［J］.Apoptosis, 2003, 8(6): 617-629.