傅 亮何 倩陳 勇孫穎鶯

（1.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.佛山市廣糧飲料食品有限公司，廣東 佛山 528137）

綠豆多肽的制備工藝及抗氧化作用

傅 亮1何 倩1陳 勇2孫穎鶯2

（1.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.佛山市廣糧飲料食品有限公司，廣東 佛山 528137）

以綠豆蛋白為原料，研究堿性蛋白酶酶解制備綠豆多肽的工藝，以水解度（DH%）為指標，得到酶解最佳條件為：酶與底物比（［E］/［S］）3.5%，溫度55℃，pH 值9.0，底物濃度為2%，酶解時間為120min?？寡趸囼灲Y果表明：綠豆多肽有良好的還原能力，其對羥自由基和超氧陰離子的清除作用的IC50分別是13.96，12.67mg/mL，抗脂質(zhì)過氧化能力的IC50為15.77mg/mL。綠豆多肽在4種抗氧化體系中均表現(xiàn)出較強的抗氧化性。

綠豆；多肽；抗氧化

綠豆是一種豆科、蝶形花亞科豇豆屬植物，富含蛋白質(zhì)、糖類、多種微量元素和人體必需維生素，其中蛋白質(zhì)含量高達19.5%～33.1%，是蛋白質(zhì)的良好來源之一［1］。而且綠豆蛋白具有良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，以及乳化性等功能特性［2～3］。中國綠豆資源十分豐富。但大多數(shù)生產(chǎn)廠家都側重于綠豆淀粉的加工生產(chǎn)，而忽略綠豆蛋白的開發(fā)［4］。

天然抗氧化肽由于具有很高的安全性和強抗氧化性，在醫(yī)藥、食品等行業(yè)的應用中已顯示出它的優(yōu)勢，已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點。目前已通過酶解大豆蛋白、大米蛋白、羅非魚皮膠原蛋白等各種不同來源的蛋白質(zhì)得到抗氧化肽［5～8］，但利用綠豆蛋白制備抗氧化肽的研究未見報道。本試驗研究堿性蛋白酶酶解制備綠豆多肽的工藝，通過考察綠豆多肽的體外抗氧化性，為制備綠豆抗氧化肽提供理論和試驗基礎，同時為開發(fā)綠豆蛋白開拓新思路，深化綠豆的綜合利用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

綠豆蛋白：綠豆蛋白含量為77.85%，本實驗室自制；

Alcalase堿性蛋白酶（粉末狀）：酶活力為2×105U/g，廣州齊云生物科技有限公司；

氫氧化鈉、鹽酸、三氯化鐵、抗壞血酸、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、三氯乙酸、硫酸亞鐵、硫代巴比妥酸（TBA）：國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

冷凍干燥機：FD－1型，北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；

膠體磨：DJM50L，上海東華高壓均質(zhì)機廠；

pH計：PHS－3C型，上海精密科學儀器有限公司；

低速離心機：KDC－12型，科大創(chuàng)新股份有限公司；

紫外可見光分光光度計：UV－9600型，北京瑞利分析儀器有限公司；

高速乳化攪拌機：JRJ－300－1型，上海標本模型廠；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF－Ⅱ型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠豆蛋白的制備 綠豆種子洗凈去雜，加水浸泡12h，去皮后勻漿，調(diào)pH至9，攪拌20min后以3 000r/min離心20min，取上清液調(diào)pH至4，再次離心后取沉淀冷凍干燥，即得綠豆分離蛋白［9］。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)含量的測定 凱氏定氮法（GB/T 5009.5——2003）。

1.3.3 蛋白水解度的測定方法 pH－stat法［10］。按式（1）計算水解度：

式中：

B—— 消耗堿量，mL；

Nb——NaOH摩爾濃度，mol/L；

Mp—— 底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；

htot——每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，綠豆的htot為7.9meq/g；

α——α－的平均解離度。

1.3.4 綠豆多肽制備工藝優(yōu)化的試驗設計 稱取適量綠豆蛋白溶于去離子水中，混勻。將溶液放置入酶解反應器中，將混合液調(diào)節(jié)到反應的溫度和pH范圍內(nèi)，緩慢攪拌的同時加入適量Alcalase堿性蛋白酶，分別改變底物濃度1%～6%（pH為9.0，［E］/［S］為3.0%，溫度為50℃，時間為60min）、pH值7.5～10.0（底物濃度為2.0%，［E］/［S］為3.0%，溫度為50℃，時間為60min）、［E］/［S］為1.5%～4.0%（底物濃度為2.0%，pH為9.0，溫度為50℃，時間為60min）、溫度40～65℃ （底物濃度為2.0%，pH 為9.0，［E］/［S］為3.0%，時間為60min）、時間30～360min（底物濃度為2.0%，［E］/［S］為3.0%，pH為9.0，溫度為50℃），考察對水解度的影響。在單因素試驗的基礎上利用4因素3水平L9（34）正交分析方法設計試驗，得出最優(yōu)工藝條件。

1.3.5 綠豆多肽抗氧化性的測定

（1）綠豆多肽還原力的測定：在25mL比色管中先加入1mL不同濃度的樣品，再加2.5mL，1%的 K3Fe（CN）6溶液及2.5mL，pH 6.6的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，混勻，50℃下保溫20min，之后加入2.5mL，10%的 TCA，再次混勻后3 000r/min離心10min，取2.5mL上清液，然后加入2.5mL去離子水及0.5mL，0.1%的FeCl3溶液，混勻后在700nm測A值［11］。

（2）綠豆多肽對羥基自由基的清除作用：利用Fenton反應產(chǎn)生羥基自由基（·OH），水楊酸能夠有效捕捉·OH，生成有色物質(zhì)2，3－二羥基苯甲酸，其在510nm處有強吸收。

在25mL的比色管中依次移取5mL，2mmol/L硫酸亞鐵溶液和5mL，6mmol/L雙氧水溶液，混合均勻后用6mmol/L水楊酸溶液定容至刻度，搖勻后立即測Ao值。在Ao值測定體系中，加入1mL不同濃度樣品溶液，搖勻后立即在510nm測A1值［12］。綠豆多肽濃度設計：0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00mg/mL。清除率按式（2）進行計算：

（3）綠豆多肽對超氧陰離子的清除作用：鄰苯三酚在弱堿條件下發(fā)生自氧化反應產(chǎn)生O2－·，O2－·能加速鄰苯三酚自氧化速率，O2－·抑制劑減緩其氧化速率，從而使氧化產(chǎn)物在325nm下的吸收峰減小。

依次取2.25mL，pH 8.34的50mmol/L磷酸鹽緩沖液，去離子水2mL，0.25mL，10mmol/L的鄰苯三酚在25mL比色管中，混勻后25℃下保溫，準確計時3min后，立即加入1滴10mol/L鹽酸使反應中止。在325nm測得A0值。在A0的測定體系中，加入2mL樣液代替去離子水，即可測得綠豆多肽濃度設計：0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00mg/mL。清除率按式（3）進行計算：

（4）綠豆多肽抗脂質(zhì)氧化作用：脂質(zhì)體的制備參考文獻［14］的方法并進行改良：新鮮卵黃加入 pH 7.4的 PBS（0.1mol/L）配成10% （V/V）懸浮液，在冰浴下高速乳化剪切10min，4℃超聲波處理20min，4℃密封保存。使用前，磁力攪拌5min。

在25mL比色管中依次加入0.5mL脂質(zhì)體，0.1mL一定濃度的樣品，加去離子水至1mL，再加入0.05mL FeSO4（70mmol/L）后37℃恒溫水浴0.5h。然后加入0.5mL TCA（10%）與1mL硫代巴比妥酸（1%），沸水中水浴10min后4 000r/min離心15min，上清液532nm處測定吸光度A1。對照管用去離子水代替樣品測定吸光度A0［15］。綠豆多肽濃度設計：0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00mg/mL。抑制率按式（4）進行計算：

1.3.6 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)用EXCEL軟件分析處理，用平均數(shù)±標準差來表示，并采用二階多項式進行擬合，但只適用于已知數(shù)據(jù)范圍內(nèi)的計算，不能外推。

2 結果與分析

2.1 正交試驗設計優(yōu)化堿性蛋白酶酶解條件

根據(jù)前期單因素結果，選擇溫度為50～60℃、pH為8～9、底物濃度為2%～4%，［E］/［S］為2.5%～3.5%進行4因素3水平（L9（34））的正交試驗。水解時間為120min。因素和水平的取值及結果分析見表1～2。

表1 Alcalase堿性蛋白酶正交試驗的因素水平設計Table 1 Design of factors and levels of orthogonal experiment for Alcalase protease

表2 Alcalase堿性蛋白酶正交試驗結果Table 2 Results of the orthogonal experiment of Alcalase protease

由表2可知，影響水解反應的主次關系為C＞B＞A＞D，即［E］/［S］＞溫度＞pH＞底物濃度；最優(yōu)組合為C3B2A3D1。堿性蛋白酶水解綠豆蛋白的最佳條件為［E］/［S］3.5%，溫度55℃，pH值9.0，底物濃度為2%，酶解時間為120min。照此條件進行驗證實驗，水解度達到23.90%。優(yōu)于正交試驗的9組試驗結果。

2.2 綠豆多肽的抗氧化作用

2.2.1 綠豆多肽的還原能力 由圖1可見，綠豆多肽樣品隨著濃度的增加，A700值增大，表明還原能力隨之增大，還原力與其濃度成量效關系。在試驗劑量范圍內(nèi)綠豆多肽還原能力比VC低。25.00mg/mL濃 度 的 綠 豆 多 肽A700值 為0.413±0.011，還原能力相當于0.38mg/mL濃度的VC。

圖1 綠豆多肽和VC的還原力Figure 1 The reductive activity of mung bean polypeptide and VC

2.2.2 綠豆多肽對羥自由基的清除作用 由圖2可知，綠豆多肽對羥自由基的清除能力隨著濃度增加而增大，在25.00mg/mL時清除率達到57.33%±1.25%。其回歸方程為y＝ －0.112 9x2＋4.847 9x＋4.329 2，R2＝0.983 9，求得綠豆多肽的IC50是13.96mg/mL，表現(xiàn)出對羥自由基良好的清除效果。

圖2 綠豆多肽對·OH的清除效果Figure 2 The·OH scavenging effects of mung bean polypeptide

2.2.3 綠豆多肽對超氧陰離子的清除作用 由圖3可知，在0.10～25.00mg/mL的濃度范圍內(nèi)，綠豆多肽對超氧陰離子表現(xiàn)出良好的清除效果，并隨濃度的增加，清除率增大。在25.00mg/mL時達到65.79%±2.34%。其回歸方程為y＝ －0.104 2x2＋5.137 4x＋1.636 3，R2＝0.994 4，求得IC50是13.96mg/mL，表明綠豆多肽對超氧陰離子有較強的清除作用。

2.2.4 綠豆多肽的抗脂質(zhì)氧化能力 由圖4可知，綠豆多肽對脂質(zhì)過氧化的抑制率都隨濃度的增加不斷變大，且抑制率與濃度呈明顯的量效關系。在25.00mg/mL時達到53.16%±2.5%，其回歸方程為y＝ －0.107 3x2＋4.515 2x＋5.480 2，R2＝0.989 1，得IC50為15.77mg/mL，表明綠豆多肽對脂質(zhì)氧化有較強的抑制作用。

3 結論

通過正交試驗設計優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶酶解綠豆蛋白工藝，得到制備綠豆多肽的最佳工藝為［E］/［S］3.5%，溫度55℃，pH 值9.0，底物濃度為2%，酶解時間為120min。在此條件下試驗，水解度達到23.90%。

圖4 綠豆多肽的抗脂質(zhì)氧化能力Figure 4 The antioxidant effects on lipids of mung bean polypeptide

本試驗考察了綠豆多肽在4種化學體系中的體外抗氧化作用，25.00mg/mL濃度的綠豆多肽還原能力相當于0.38mg/mL濃度的VC，綠豆多肽對羥自由基和超氧陰離子的清除作用的IC50分別為13.96，12.67mg/mL，對脂質(zhì)過氧化抑制作用的IC50為15.77mg/mL。在此4種體系中，綠豆多肽均證明了其良好的抗氧化能力。將試驗制備的綠豆多肽與其他蛋白來源制備的抗氧化肽對比，其還原能力要高于大豆肽［3］，但低于羅非魚皮膠原肽［6］；對·OH 的清除率卻高于羅非魚皮膠原肽以及大米蛋白肽［5］，但低于大豆肽［3］；對 O2－·的清除率高于大豆肽［4］，低于大米蛋白肽［5］；對脂質(zhì)過氧化的抑制率高于羅非魚皮膠原肽［6］。綠豆多肽在這4種體系中表現(xiàn)出不同的抗氧化能力，其具體原因仍有待研究。

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Preparation and effects of antioxidant activity of mung bean polypeptides

FU Liang1HE Qian1CHEN Yong2SUN Ying－ying2

（1.Dept.of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou，Guangdong510632，China；2.Foshan Guangliang Drink and Food Inc.，F(xiàn)oshan，Guangdong528137，China）

Mung bean polypeptides were produced by Alcalase hydrolysis mung bean protein.The degree of hydrolysis（DH%）was used as the indicators to determine the optimum enzymolysis conditions.The results showed：enzyme to substrate ratio（［E］/［S］）is 3.5%，temperature is 55℃，pH value is 9.0，mung bean protein concentration is 2%and hydrolysis time is 120min.The antioxidant activity of mung bean polypeptides were as follows：mung bean polypeptides had good reductive activity，theIC50of hydroxyl radicals scavenging，hydrogen peroxide scavenging and liposome peroxide were 13.96mg/mL，12.67mg/mL and 15.77mg/mL respectively.Mung bean polypeptides showed strong antioxidant capacity in the four antioxidant experiments.

mung bean；polypeptide；antioxidant activity

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

傅亮（1968－），男，暨南大學副教授。E－mail：fuliang＠188.com

何倩

2010－05－30