訶子中活性物質(zhì)的提取及其抗氧化、抑菌作用研究

王 雙王昌濤都曉偉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.北京工商大學(xué)植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

訶子中活性物質(zhì)的提取及其抗氧化、抑菌作用研究

王 雙1王昌濤2都曉偉1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.北京工商大學(xué)植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

利用微波法提取訶子中抗氧化活性物質(zhì)。以抗氧化活性為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法研究溫度、時(shí)間、料液比對(duì)產(chǎn)物抗氧化活性的影響。在溫度53.6℃，時(shí)間3min，料液比1∶19（m∶V）的條件下，產(chǎn)物抗氧化活性即Trolox濃度為63 081μmol/L。產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子具有清除作用，其IC50值分別為0.44，1.01，0.64mg/mL，產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌有抑制作用，而對(duì)黑曲霉無(wú)抑制作用。

微波；訶子；抗氧化；功效

訶子 （terminalia chebula retz.）為使君子科欖仁樹(shù)屬植物訶子及其變種絨毛訶子的干燥成熟果實(shí)，是藏族習(xí)用藥材，被譽(yù)為“藏藥之王”［1］。訶子原產(chǎn)于印度、緬甸等地，在中國(guó)云南、廣東、廣西等地也有分布。訶子的主要成分為鞣質(zhì)和多元酚，它們可以終止自由基的連鎖反應(yīng)，具有抗氧化活性［2－8］。微波提取法是一種新型的提取技術(shù)，它具有選擇性高、提取時(shí)間短、加熱效率高、質(zhì)量好、安全無(wú)污染的特點(diǎn)［9］。迄今未見(jiàn)到微波法提取訶子成分的相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)采用微波提取技術(shù)從訶子中獲得抗氧化活性物質(zhì)，并對(duì)提取物進(jìn)行抗氧化活性及抑菌作用的功效研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

訶子：北京同仁堂藥店；

無(wú)水乙醇、30%過(guò)氧化氫：分析純，北京化工廠；

甲醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

DPPH、Trolox：純度≥98%，德國(guó)Sigma公司；

氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、番紅花紅、核黃素、EDTA－2Na、蛋氨酸：純度≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

硫酸亞鐵：分析純，天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠。

1.1.2 主要儀器

離心機(jī)：3－18K，德國(guó)Sigma公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－1，國(guó)華電器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG－9030A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平：DENVER，北京賽多利斯儀器系列有限公司；

微波儀：MARS5，培安CEM微波化學(xué)（中國(guó)）技術(shù)中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取12.5mg DPPH溶解于甲醇中，再定容至100mL，使用時(shí)稀釋5倍至25mg/L。稱取Trolox標(biāo)準(zhǔn)品適量，用乙醇分別配制為0，200，400，600，800，1 000μM 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后吸取0.1mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入3.9mL DPPH甲醇溶液，在黑暗處反應(yīng)20min后于515nm處測(cè)定吸光度A，用甲醇調(diào)零［10］。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，繪制以吸光度A為Y軸和Trolox濃度（μmol/L）為X軸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。測(cè)定樣品溶液的Trolox濃度時(shí)，所得結(jié)果乘以溶液稀釋倍數(shù)。

圖1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Trolox standard curve

1.2.2 微波法提取抗氧化活性物質(zhì)的工藝及單因素試驗(yàn)

稱取訶子粉末（過(guò)50目篩）適量，按照一定的料液比與提取溶劑混合，在一定溫度下微波提取一定時(shí)間，提取液離心，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測(cè)得Trolox濃度。分別考察乙醇濃度、料液比、溫度和時(shí)間4個(gè)單因素對(duì)抗氧化活性物質(zhì)提取的影響，確定單因素的最佳條件，再根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝。

（1）乙醇濃度單因素試驗(yàn)：該試驗(yàn)變量為乙醇濃度，其分別設(shè)為30%、40%、50%、60%、70%，固定參數(shù)包括料液比1∶30（m∶V）、微波功率1 200W、溫度60℃和時(shí)間3min，測(cè)定提取液的抗氧化能力。

（2）料液比單因素試驗(yàn)：該試驗(yàn)變量為料液比，其分別設(shè)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（m∶V），固定參數(shù)包括乙醇濃度50%、微波功率1 200W、溫度60℃和時(shí)間3min，測(cè)定提取液的抗氧化能力。

（3）溫度單因素試驗(yàn)：該試驗(yàn)變量為溫度，其分別設(shè)為40，50，60，70，80 ℃，固定參數(shù)包括乙醇濃度50%、料液比1∶20（m∶V）、微波功率1 200W和時(shí)間3min，測(cè)定提取液的抗氧化能力。

（4）時(shí)間單因素試驗(yàn)：該試驗(yàn)變量為時(shí)間，其分別設(shè)為1，3，5，7，9min，固定參數(shù)包括乙醇濃度50%、料液比1∶20（m∶V）、微波功率1 200W和溫度60℃，測(cè)定提取液的抗氧化能力。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定 采用DPPH 95%乙醇體系測(cè)定法［11］。

1.2.4 羥自由基清除率的測(cè)定 采用二價(jià)鐵離子測(cè)定法［12］。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 采用光照核黃素測(cè)定法［12］。

1.2.6 抑菌試驗(yàn) 選擇金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌、黑曲霉作為考察菌，分別使用最適培養(yǎng)基，采用濾紙片法，測(cè)量抑菌圈直徑的大小作為抑菌物質(zhì)生物效果評(píng)定的依據(jù)，抑菌圈直徑≤6mm視為無(wú)抑菌作用［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波法提取抗氧化活性物質(zhì)的單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的增大，Trolox濃度呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，Trolox濃度最大，即抗氧化活性物質(zhì)提取效果最好；隨著料液比的增大，Trolox濃度逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20（m∶V）時(shí)曲線上升趨勢(shì)趨于平緩，故料液比采用1∶20（m∶V）；隨著溫度的增高，Trolox濃度呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為60℃時(shí)Trolox濃度最大，即抗氧化活性物質(zhì)的提取效果最好；隨著時(shí)間的增加，Trolox濃度呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)時(shí)間為3min時(shí)，Trolox濃度最大，即抗氧化活性物質(zhì)的提取效果最好。

2.2 微波法提取抗氧化活性物質(zhì)的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇溫度、時(shí)間、料液比3個(gè)單因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and level of response surface experiment

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface results

2.2.2 響應(yīng)面方差分析 利用SAS軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 影響因素的方差分析Table 3 The factors affecting the variance analysis

由表3的方差分析結(jié)果可知：時(shí)間（X2）和料液比（X3）在試驗(yàn)過(guò)程中起主要作用，而溫度（X1）相對(duì)來(lái)說(shuō)作用小一些，即對(duì)微波提取法的影響效果：時(shí)間＞料液比＞溫度。

2.2.3 響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn) 利用SAS軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 模型的可信度分析的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 The statistical analysis of the credibility of the model test results

由表4中復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝97.07%，說(shuō)明方程的因變量與全體自變量之間的回歸效果顯著，可用于試驗(yàn)分析。

2.2.4 回歸方程 利用SAS程序?qū)憫?yīng)值進(jìn)行回歸分析，經(jīng)回歸擬和后得到回歸方程：

2.2.5 回歸方程方差分析 利用SAS程序?qū)貧w方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回歸方程各項(xiàng)的方差分析ńTable 5 The regression equation of variance analysis

由表5可知，方差的一次項(xiàng)顯著，二次項(xiàng)極其顯著，說(shuō)明各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系；交互項(xiàng)顯著，因此各因素之間存在交互作用，在試驗(yàn)中的影響不可忽略。另外總回歸項(xiàng)極其顯著證明回歸方程擬合程度較好，具有很高的可信性和準(zhǔn)確性；失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)的誤差很小。

2.2.6 響應(yīng)面曲面及等高線圖 利用SAS軟件得到響應(yīng)面曲面及等高線圖，見(jiàn)圖2～4。

圖2 溫度和時(shí)間對(duì)Trolox濃度的響應(yīng)曲面及等高線圖Figure 2 Trolox concentration response surface on temperature and time

圖3 溫度和料液比對(duì)Trolox濃度的響應(yīng)曲面及等高線圖Figure 3 Trolox concentration response surface on temperature and solid to liquid ratio

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，由模型求偏導(dǎo)計(jì)算得出最佳提取工藝的反應(yīng)條件為：溫度為53.6℃，時(shí)間為3min，料液比為1∶19（m∶V）。為了驗(yàn)證響應(yīng)條件的正確性，按照最佳提取條件組合進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，該工藝下提取液的抗氧化能力即Trolox濃度為62 870μmol/L，與理論值（63 081μmol/L）接近，故響應(yīng)條件具有較高的可靠性和重復(fù)性。

圖4 時(shí)間和料液比對(duì)Trolox濃度的響應(yīng)曲面及等高線圖Figure 4 Trolox concentration response surface on time and solid to liquid ratio

2.3 提取物抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 提取物對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定 根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL溶液，根據(jù)1.2.3方法測(cè)定DPPH自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 DPPH自由基清除率的測(cè)定Figure 5 DPPH radicals clearance

由圖5可知，隨著訶子提取物濃度的增大，DPPH自由基清除率逐漸增大，當(dāng)訶子提取物的濃度為1.0mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到90%以上，其IC50值為0.44mg/mL。

2.3.2 提取物對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定 根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mg/mL溶液，根據(jù)1.2.4方法測(cè)定羥自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 羥自由基清除率的測(cè)定Figure 6 Hydroxyl radicals clearance

由圖6可知，隨著訶子提取物濃度的增大，羥自由基清除率逐漸增大，當(dāng)訶子提取物的濃度為1.8mg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到80%以上，其IC50值為1.01mg/mL。

2.3.3 提取物對(duì)超氧陰離子清除率的測(cè)定 根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL溶液，根據(jù)1.2.5方法測(cè)定超氧陰離子清除率，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，隨著訶子提取物濃度的增大，超氧陰離子清除率逐漸增大，當(dāng)訶子提取物的濃度為1.0mg/mL時(shí)，超氧陰離子清除率達(dá)到80%以上，其IC50值為0.64mg/mL。

圖7 超氧陰離子清除率的測(cè)定Figure 7 Super oxide anion clearance

2.4 提取物抑菌作用的測(cè)定

根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成0.5，0.05，0.005g/mL溶液，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，根據(jù)1.2.6方法測(cè)量抑菌圈直徑大小，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，當(dāng)訶子提取物的濃度為0.5g/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌均具有較好的抑制作用，而對(duì)黑曲霉無(wú)抑制作用；當(dāng)訶子提取物的濃度為0.05g/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有抑制作用，而對(duì)大腸桿菌和黑曲霉無(wú)抑制作用；當(dāng)訶子提取物的濃度為0.005g/mL時(shí)，對(duì)4種菌均無(wú)抑菌作用。訶子提取物對(duì)這4種菌的抑制作用大小順序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌、白色念珠菌＞大腸桿菌＞黑曲霉，其中金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最小抑菌濃度為0.005g/mL，大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.05g/mL。

表6 不同濃度提取液的抑菌作用測(cè)定Table 6 Different concentrations extract bacteriostatic action

3 討論

（1）微波法提取訶子中抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝為：溫度為53.6℃，時(shí)間為3min，料液比為1∶19（m∶V），通過(guò)研究訶子的微波提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除作用，可知訶子的微波提取物具有較好的抗氧化活性，對(duì)自由基的清除作用大小依次為清除DPPH自由基作用＞清除超氧陰離子作用＞清除羥自由基作用。

（2）訶子的微波提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均有抑制作用，而對(duì)黑曲霉無(wú)抑制作用，抑制作用大小依次為抑制金黃色葡萄球菌、白色念珠菌＞抑制大腸桿菌＞抑制黑曲霉。

（3）自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，能夠損害機(jī)體的細(xì)胞和組織，甚至引起衰老效應(yīng)或者慢性疾病，本試驗(yàn)對(duì)訶子的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，為其在醫(yī)藥和保健等方面的深入研究和應(yīng)用提供參考和依據(jù)，而對(duì)于訶子抗氧化活性成分的分離純化方面還有待于進(jìn)一步深入的研究。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).ISBN 7－5025－6525－6/R·262中華人民共和國(guó)藥典［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

2 楊懷霞，馬慶一，楊林莎.茶葉及訶子等植物提取物的抗氧化作用［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2003，38（3）：413～415.

3 羅霄山，陳玉興，張誠(chéng)光.訶子不同炮制品抗氧化作用的試驗(yàn)研究［J］.中藥材，2008，31（7）：966～967.

4 貝玉祥，郭英，何超，等.訶子多酚的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性的研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30（11）：6～9.

5 汪詠梅，陳笳鴻，吳冬梅，等.余甘子樹(shù)皮提取物抗氧化及清除自由基活性初步研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2008，28（1）：11～15.

6 Jessica G，ScottW B，Victor M D－U，et al.Free radicals，mitochondria，and oxidized lipids：The emerging role in signal transduction in vascular cells［J］.Circulation Research，2006，99（9）：924～932.

7 Cheng F C，Jen J F，Tsai T H.Hydroxyl radical in living systems and it s separation methods［J］.Journal of Chromatography B，2002，7（8）：481～496.

8 Perumal S，Klaus B .The antioxidant and free radical scavenging activities of rocessed cowpea （Vigna unguiculata （L.）Walp.）seed extracts［J］.Food Chemistry，2007，10（1）：10～19.

9 文良娟，王嵬，麥秋梅.微波法提取菠蘿皮中抗氧化活性物質(zhì)的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（12）：210～214.

10 王曉宇.葡萄酒抗氧化活性及其檢測(cè)方法的研究［D］.陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

11 段靜雨，李巖，王健慧，等.DPPH法測(cè)定金絲梅體外抗氧化活性［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29（9）：618～620.

12 貝玉祥，郭英，范逸平，等.訶子多酚清除活性氧自由基及體外抗氧化作用研究［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，18（1）：51～54.

13 劉明霞.化香樹(shù)果序中多酚提取純化工藝及體外抑菌活性研究［D］.陜西：西北大學(xué)，2009.

Research of antioxidant activity in fructus chebulae

WANG Shuang1WANG Chang－tao2DU Xiao－wei1

（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang150040，China；2.Beijing Technology and Business University，Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing100048，China）

This experiment extracted antioxidant substances from Terminalia Chebulae Retz in Microwave method.Regard the antioxidant activity as an index，the effect of temperature，time，and the liquid ratio on the antioxidant activity was studied by the response surface analysis.Under the conditions of 53.6 ℃ extracting temperature，3 min extracting time，and liquid ratio 1∶19（m∶V），the concentration of Trolox is 63 081μmol/L.Products has scavenging action to DPPH radical，hydroxyl radical，superoxide anion，IC50were 0.44，1.01，0.64mg/mL respectively.And Staphylococcus aureus，Candida albicans，E.coliwere inhibited，while no inhibitory effect on Aspergillus Niger.

microwave；fructus chebulae；antioxidant activity；effect

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

北京市科技新星項(xiàng)目（編號(hào)：2008B08）

王雙（1985－），女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：wangs1985＠126.com

都曉偉

2010－07－12