潘彬也，高艷玲，歐陽(yáng)夷，張少輝

（上海交通大學(xué)a.農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院；b.陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

釀酒酵母純化低聚半乳糖

潘彬也a，高艷玲a，歐陽(yáng)夷a，張少輝b

（上海交通大學(xué)a.農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院；b.陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

使用β-乳糖酶制得含低聚半乳糖的混合溶液，添加4種釀酒酵母對(duì)其使用微生物法純化，采用脈沖安培檢測(cè)器與高效陰離子交換色譜結(jié)合法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組中低聚半乳糖純度均有明顯提高，其中釀酒酵母GIM 2.91效果尤為顯著，將低聚半乳糖純度從對(duì)照組的30.76%提高至39.52%，升幅達(dá)28.48%。

低聚半乳糖；純化；釀酒酵母

0 引 言

低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharides，簡(jiǎn)稱GOS）是一種功能性低聚糖，能改善腸道微生態(tài)平衡、防止便秘等[1-4]。酶法制備低聚半乳糖被廣泛采用[5，6]。但產(chǎn)物中大量雜糖的存在掩蓋了其功能特性，如葡萄糖會(huì)其會(huì)嚴(yán)重干擾其生理功能[7]。

目前低聚糖分離提純的方法主要有色譜柱分離法[8]、膜分離法[9]、酶法[10]和微生物發(fā)酵法[11]。 其中微生物發(fā)酵法對(duì)設(shè)備要求低，分離周期短且能耗相對(duì)較低[12]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Hansen）可將葡萄糖葡萄糖、半乳糖等單糖吸入細(xì)胞內(nèi)，酶解其為二氧化碳和酒精[13]。本工作擬用該微生物菌株作用于酶法制備的低聚半乳糖混合溶液，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)反應(yīng)前后低聚半乳糖的純度變化，為今后研究單一組分低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)與功能特性打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物菌種由廣東省微生物菌種保藏中心提供：釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（編號(hào)GIM 2.34）；橢圓釀酒酵母Saccharomyces cervisiae Hansen var.ellipsoideus（Hansen）Dekker（編號(hào)GIM 2.91）；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（編號(hào)GIM 2.92）；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Hansen（編號(hào)GIM 2.95）。

乳糖酶β-Galactosidase[14]（米曲霉）。

1.2 儀器與設(shè)備

DX-600型離子色譜儀（配有GP50梯度泵），戴安中國(guó)有限公司；ED50電化學(xué)檢測(cè)器（金工作電極、Ag/AgCl參比電極），戴安中國(guó)有限公司；Chromeleon色譜工作站，戴安中國(guó)有限公司；CarboPacTMPA-1分析柱（4 mm×250 mm），戴安中國(guó)有限公司；CarboPacTMPA1保護(hù)柱（4 mm×50 mm），戴安中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制備含低聚半乳糖溶液

制備5瓶100 mL體積分?jǐn)?shù)為32%的乳糖溶液，經(jīng)121℃下高壓滅菌15 min，溶液冷卻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1‰乳糖酶，在適宜溫度下培養(yǎng)24 h后滅活。

1.3.2微生物法處理

將微生物菌種接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)各兩管，其中一管劃平板，若菌種單一且長(zhǎng)勢(shì)良好，則保留另一管以待添加。向制得的5瓶低聚半乳糖底物溶液中添加等量四種釀酒酵母，在各菌的最適溫度下反應(yīng)24 h后滅活，留一瓶不作處理，作為空白對(duì)照。

1.3.3 樣品的預(yù)處理

使用纖維素膜（0.22 μm）過(guò)濾樣品溶液，除掉乳糖溶液可能對(duì)分析柱、檢測(cè)器等產(chǎn)生污染和干擾的大分子物質(zhì)，再用疊氮化鈉溶液稀釋10 000倍后送檢。

1.3.3 低聚半乳糖的檢測(cè)

采用離子色譜法，配合四電位脈沖安培檢測(cè)器，利用混合溶液梯度淋洗，對(duì)GOS進(jìn)行檢測(cè)[15～18]。檢測(cè)條件：流速1 mL/min,檢測(cè)溫度室溫，進(jìn)樣體積20 L，采用梯度洗脫法，通34.475 kPa氮?dú)鈾z測(cè)，積分脈沖安培4電位波形檢測(cè)法，其檢測(cè)電壓分別為：E1=+0.10 V，E2=-2.00 V，E3=+0.60 V，E4=-0.10 V。

1.4 色譜圖計(jì)算

對(duì)比對(duì)照組的色譜圖，確定實(shí)驗(yàn)組中各峰成分。按以下公式計(jì)算出該成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)[19]。將對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行對(duì)比。

每組結(jié)果中，低聚糖峰的數(shù)量為低聚糖的種類數(shù)，所有低聚糖量的疊加為其低聚半乳糖總量，對(duì)比各組低聚半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

預(yù)處理后的空白對(duì)照組樣品色譜圖如圖1所示。同時(shí)對(duì)相同預(yù)處理?xiàng)l件下的4組實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，待繪制出色譜圖及色譜參數(shù)后，以標(biāo)準(zhǔn)物色譜峰為根據(jù)進(jìn)行定性與定量分析，以GIM 2.91為例，色譜圖如圖2所示。

圖1中，對(duì)應(yīng)色譜峰出峰時(shí)間：1為半乳糖9.00 min；2為葡萄糖10.20 min；3,4為3-α-半乳二糖類16.93 min和19.92 min；5為乳糖20.48 min；6為異構(gòu)別乳二糖類23.50 min；7,8為三聚半乳二糖類24.82 min和26.20 min；9～12為四聚半乳二糖類28.65，29.63，33.07，34.70 min。

根據(jù)對(duì)照組色譜圖確定樣品色譜峰的成分，如圖2確定峰1、峰2、峰5分別為半乳糖峰。葡萄糖峰和乳糖峰，介于葡萄糖峰與乳糖峰間的峰為3-α-半乳二糖類，乳糖峰后，24 min之前的成分為異構(gòu)別乳二糖類，24 min到27 min間為三聚半乳二糖類，之后為四聚半乳二糖類。兩圖對(duì)比，可見(jiàn)峰的形狀相似，但實(shí)驗(yàn)組釀酒教母GIM 2.91的低聚糖峰數(shù)目增加，面積也相對(duì)增大。確定峰的成分后，根據(jù)1.4中色譜圖計(jì)算方法對(duì)各峰進(jìn)行定量分析。

圖2中，對(duì)應(yīng)色譜峰出峰時(shí)間：1為半乳糖8.97 min；2為葡萄糖10.17 min；3,4為3-α-半乳二糖類16.85 min和19.90 min；5為乳糖20.50 min；6,7為異構(gòu)別乳二糖類21.40 min和23.50 min；8,9為三聚半乳二糖類24.87 min和26.25 min；10～13為四聚半乳二糖類28.02，28.75，29.75，33.27 min。

經(jīng)過(guò)對(duì)色譜儀原始數(shù)據(jù)表格的分析計(jì)算，得出低聚半乳糖溶液空白對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組的各項(xiàng)參數(shù)如表1所示。并根據(jù)此結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

表1 各組樣品低聚半乳糖量檢測(cè)結(jié)果g

為更加直觀地觀察實(shí)驗(yàn)組與空白組的區(qū)別，擬將各組樣品的單糖量（葡萄糖、半乳糖）進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖3所示；將各組樣品中低聚半乳糖占總糖比例，即低聚糖純度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖4所示。

由圖3可以看出，添加釀酒酵母能明顯降低樣品中的單糖量，葡萄糖量由空白組的9.51 g降至7.77 g至7.07 g不等，半乳糖量由5.07 g降至4.30 g至3.50 g不等。其中釀酒酵母GIM 2.91（橢圓釀酒酵母Saccha-romycescervisiaeHansenvar.ellipsoideusHansen Dekker）的發(fā)酵作用最佳，將葡萄糖量減少至7.07 g，幅度達(dá)25.66%；半乳糖量降至3.50 g，降幅30.97%；單糖總量14.58 g降至10.57 g，降幅27.50%。

圖3中，每實(shí)驗(yàn)組第1列柱形代表單糖總量，第2列代表葡萄糖總量，第3列代表半乳糖總量。

正由于釀酒酵母對(duì)單糖的發(fā)酵作用，樣品中的低聚半乳糖的相對(duì)量大大提高（圖4）。其中發(fā)酵能力最強(qiáng)的釀酒酵母GIM 2.91，將低聚半乳糖在總糖中所占比例由空白組的30.76%提高至39.52%，提高近9個(gè)百分點(diǎn)，效果非常明顯。

提高低聚糖純度的同時(shí)，添加釀酒酵母也豐富了低聚半乳糖的種類。菌種GIM 2.92及GIM 2.95讓低聚半乳糖的種類由原先的9種增加為11種（表1）。推測(cè)是微生物體內(nèi)豐富的酶類催化了低聚糖的結(jié)構(gòu)異化反應(yīng)，有待研究。

3 結(jié) 論

低聚半乳糖作為一種功能性食品，是食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。酶法制備低聚半乳糖的產(chǎn)物為葡萄糖、半乳糖、乳糖及GOS的混合物，但其中大量雜糖的存在掩蓋了其功能特性。向酶法制備的低聚半乳糖底物溶液中添加4種釀酒酵母，采用離子色譜-脈沖安培檢測(cè)器對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證明了釀酒酵母對(duì)單糖的發(fā)酵分解能力，其中菌種GIM 2.91的發(fā)酵能力尤為顯著，將單糖總量降低了27.50%，從而大大提高了樣品中的低聚半乳糖的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，低聚半乳糖比例由空白組的30.76%提高至39.52%。同時(shí)，釀酒酵母的加入豐富了低聚半乳糖的種類，具體原因有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)證明釀酒酵母法可在一定程度上對(duì)酶法制備的低聚半乳糖溶液進(jìn)行純化，減少單糖對(duì)檢測(cè)的干擾，為今后單一組分低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)與功能特性研究打下基礎(chǔ)。

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Galacto-oligosaccharide purification by Saccharomyces cerevisiae Hansen

PAN Bin-yea,GAO Yan-linga,OUYANG Yia,ZHANG Shao-huib
（Shanghai Jiaotong University a.College of Agriculture and Biology;b.Bor S.Luh Food Safety Research Center,Shanghai 200240,China）

Add four kinds of saccharomyces cerevisiae hansen to galacto-oligosaccharide（GOS）mixture made by β-galactosidase and analyze the results with high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector（HPAEC-PAD）.The results show significant improvement of galacto-oligosaccharide purity,especially when treated by saccharomyces cerevisiae hansen GIM 2.91.Saccharomyces cerevisiae hansen GIM 2.91raises the purity of galacto-oligosaccharide by 28.48%,from 30.76%to 39.52%.

galacto-oligosaccharide；purification；saccharomyces cerevisiae Hansen

Q93-33

A

1001-2230（2011）08-0008-03

2011-05-09

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2008AA10Z329）。

潘彬也（1988-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

張少輝