圖 雅 張海燕

（內(nèi)蒙古呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特 010070）

HPLC法測(cè)定豬肝中阿苯達(dá)唑殘留量的測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)

圖 雅*張海燕

（內(nèi)蒙古呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特 010070）

建立了HPLC法分析豬肝中阿苯達(dá)唑殘留量測(cè)定結(jié)果的不確定度數(shù)學(xué)模型，對(duì)測(cè)定過(guò)程中的不確定度來(lái)源進(jìn)行逐層分析和合成。分析結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品的配制、稀釋及試驗(yàn)過(guò)程中隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度分量是影響阿苯達(dá)唑殘留量測(cè)定結(jié)果不確定度的主要因素。

高效液相色譜法；不確定度；阿苯達(dá)唑；豬肝

不確定度評(píng)定是中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)評(píng)定檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量水平的重要指標(biāo)，也是判斷檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的依據(jù)。合理地評(píng)定測(cè)量結(jié)果的不確定度對(duì)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)、實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制及方法的確認(rèn)等方面都具有重要的意義。本研究對(duì)用HPLC法測(cè)定豬肝中阿苯達(dá)唑的結(jié)果進(jìn)行了不確定評(píng)估，并對(duì)影響不確定度因素進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian Prostar240高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器。阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr.Ehrenstofer公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密稱(chēng)取10.0 mg阿苯達(dá)唑，用甲醇溶解并定容至100.00 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間工作液的配制

準(zhǔn)確吸取阿苯達(dá)唑儲(chǔ)備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別吸取0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、4.00 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，用流動(dòng)相稀釋定容至10.00 mL。質(zhì)量濃度分別為 0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.40μg/mL。

1.3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5.0 g置于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩5 min，8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中。再向離心管中加入20 mL乙酸乙酯，渦旋離心，重復(fù)提取一次，合并上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。向雞心瓶加入2 mL乙腈，超聲3 min，加入5 mL正己烷溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層。下層提取液過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取小柱凈化，50℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入2.00mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)^(guò)微孔濾膜，上HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：AgilentXDBC18柱（4.6mm×250mm）；柱溫：室溫；

流動(dòng)相：0.05 mol/mL乙酸銨溶液（pH=5） +乙腈+質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液，梯度洗脫；

流速：1.0 mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：292 nm；

進(jìn)樣量：50 μL。

2 數(shù)學(xué)模型

式中：X——樣品中阿苯達(dá)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；

C0——定溶液中阿苯達(dá)唑質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——定容體積，mL；

fRec——回收率校正因子；

fran——隨機(jī)效應(yīng)校正因子；

m——樣品取樣量，g。

樣品中阿苯達(dá)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：

3 不確定度的來(lái)源分析

從試驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，阿苯達(dá)唑殘留量測(cè)量的不確定度主要來(lái)源可歸納為以下幾方面：

a） 試樣處理液中阿苯達(dá)唑含量測(cè)定值C0引入的不確定度：主要是擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液-峰面積曲線校準(zhǔn)得出C0產(chǎn)生的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量配制稀釋時(shí)所引入的不確定度，后者主要包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度ua；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量產(chǎn)生的不確定度ub；標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程使用的玻璃量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度uc及標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程溫度變化引入的不確定度ud。

b） 樣品稱(chēng)量m引入的不確定度。

c） 體積V引入的不確定度。

d） 樣品前處理對(duì)樣品回收率的影響引入的不確定度。

e） 測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度。

4 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的量化

根據(jù)不確定度來(lái)源分析對(duì)各分量分別進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)。

4.1 樣液中阿苯達(dá)唑殘留量的測(cè)定值C0引入的不確定度

4.1.1 校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

為校準(zhǔn)高效液相色譜儀，采用對(duì)阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)濃度系列進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定，得到峰面積y，用最小二乘法擬合得到直線方程y=bx+a（a為截距，b為斜率）。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)

由最小二乘法得到擬合直線的斜率b和截距a分別為：

阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差S為：

應(yīng)用該校準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)量時(shí)，對(duì)樣液進(jìn)行2次測(cè)量（即p=2），測(cè)得樣液中阿苯達(dá)唑的含量為0.195 μg/mL，則擬合校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（C0）為：

4.1.2 配制阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度

4.1.2.1 由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)提供的信息，阿苯達(dá)唑的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.5%，并指明包含因子k=2，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.1.2.2 稱(chēng)量阿苯達(dá)唑產(chǎn)生的不確定度

阿苯達(dá)唑稱(chēng)樣量為10.00 mg，根據(jù)天平檢定證書(shū)給出的信息，其質(zhì)量允差為0.10 mg，取正態(tài)分布，則稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.1.2.3 阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度

阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程中使用了一系列玻璃量具，根據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG196-1990》提供的信息，各量器均有相應(yīng)的最大允差，按照矩形分布考慮，由此估算各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中量具引入的不確定度

由表2數(shù)據(jù)的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.1.2.4 阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程中溫度變化引入的不確定度

由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的溫度缺乏控制而產(chǎn)生的不確定度。該不確定度可通過(guò)估算環(huán)境溫度變化范圍和液體的體積膨脹系數(shù)進(jìn)行估算。溫度變化范圍為±4℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按矩形分布考慮，由溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見(jiàn)表3。

由表3數(shù)據(jù)的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量配制稀釋時(shí)產(chǎn)生的不確定度的合成

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中溫度變化引入的不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、稱(chēng)量、溫度變化和量具校準(zhǔn)所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 樣品稱(chēng)量引入的不確定度

用萬(wàn)分之一天平，其分度值為0.1 mg，稱(chēng)樣品5 g，取矩形分布，引入的不確定度為：

4.3 樣品處理后定容體積引入的不確定度

樣品經(jīng)萃取、凈化、氮?dú)獯蹈珊?，? mL的單線標(biāo)吸管取2.00 mL流動(dòng)相溶解并定容。2 mL單線標(biāo)吸管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定包含校準(zhǔn)引入的不確定度和溫度變化引起的不確定度。

根據(jù)證書(shū)其最大允許差為±0.015 mL，取均勻分布，引入的不確定度為：

根據(jù)制造商提供的信息，所用量具已在20℃校準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)室的溫度在±4℃之間變動(dòng)，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按矩形分布考慮，由溫度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.4 萃取、凈化過(guò)程對(duì)樣品回收率的影響

萃取、凈化過(guò)程對(duì)樣品回收率的影響所產(chǎn)生的不確定度應(yīng)根據(jù)6次樣品添加回收率的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。6次阿苯達(dá)唑回收率的測(cè)定結(jié)果分別為：87.1%、86.2%、87.1%、84.9%、87.1%、84.9%，平均回收率Rec為86.2%，標(biāo)準(zhǔn)偏差SRec=1.08%，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同時(shí)，必須對(duì)阿苯達(dá)唑的回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以確定回收率校正因子是否在計(jì)算公式中采用。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，當(dāng)t值大于或等于臨界值 t（95，5）=2.57 時(shí)，則 Rec 與 100%有顯著性差異，說(shuō)明必須在計(jì)算公式中使用fRec修正結(jié)果；若 t值小于臨界值 t（95，5）=2.57 時(shí)，則 Rec 與100%無(wú)顯著性差異，說(shuō)明不必采用fRec修正計(jì)算結(jié)果。計(jì)算結(jié)果如下：

t值遠(yuǎn)大于臨界值 t（95，5）=2.57，說(shuō)明與 100%有顯著性差異，必須在計(jì)算公式中采用修正結(jié)果。

4.5 測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度

包括樣品的均勻性和代表性、天平的重復(fù)性、體積刻度充滿(mǎn)的重復(fù)性、進(jìn)樣的重復(fù)性和液相色譜儀積分重復(fù)性等因素引入的不確定度。通過(guò)重復(fù)測(cè)定樣品中的阿苯達(dá)唑殘留量來(lái)進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度評(píng)定結(jié)果

樣品中阿苯達(dá)唑殘留量含量?jī)纱螠y(cè)定的結(jié)果分別為 0.082 μg/kg、0.074 μg/kg，平均值為0.078 μg/kg。

5 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度與結(jié)果表述

6 討 論

分析結(jié)果表明，本試驗(yàn)中影響測(cè)量不確定度的主要因素是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量配制過(guò)程及隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度。通過(guò)選用精密度較高的玻璃量具配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，增加樣品的測(cè)定次數(shù)，可減小引入的不確定度。

本研究建立了HPLC法分析豬肝中阿苯達(dá)唑殘留量測(cè)定結(jié)果的不確定度模型，評(píng)定了該方法的測(cè)量不確定度，為正確評(píng)價(jià)和使用檢測(cè)數(shù)據(jù)提供了依據(jù)，同時(shí)為利用高效液相色譜法測(cè)定其他獸藥殘留量的不確定度評(píng)定提供了有益的參考。

［1］中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2002.

［2］李慎安，施昌彥，劉風(fēng).JJF1059-1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1999.

［3］林小莉，張巍，董艷峰.高效液相色譜法測(cè)定青霉素鈉含量的測(cè)量不確定度評(píng)定［J］.中國(guó)獸藥雜志，2009，43（4）：25-28.

［4］倪育才.實(shí)用測(cè)量不確定度評(píng)定［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2007.

Uncertainty evaluation in the determination of albendazole in liver by HPLC

TUYa*ZHANGHai-yan
（Hohhot CDC，Hohhot in inner mongolia，Hohhot 010070 ，China）

Established mathematical model of uncertainty evaluation for determining the concentration of albendazole in liver by HPLC.The sources of uncertainty were analyzed to compose steps for whole determination procedure.Analysis showed that the main factors affecting the determination of albendazole were preparation of reference materials，dilution，and randomeffects duringdetermination.

HPLC；uncertaintyevaluation；albendazole；liver

TS251.7

A

1673-6004（2011）03-0056-04

* 圖雅，女，1983年出生，2007年畢業(yè)于內(nèi)蒙古大學(xué)物理化學(xué)專(zhuān)業(yè)，碩士研究生，檢驗(yàn)師。

2011-08-24