陳 跡， 王建華

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830054)

阿苯達(dá)唑被廣泛應(yīng)用于臨床治療鉤蟲病、蛔蟲病、鞭蟲病、蟯蟲病、旋毛蟲病、絳蟲病、囊蟲病等寄生蟲病，臨床療效良好。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)阿苯達(dá)唑也是一種較為有效的治療包蟲病的藥物[1]。但由于阿苯達(dá)唑?qū)儆陔y溶性藥物，口服后腸道吸收差，生物利用度相對(duì)較低，治療包蟲病病灶局部藥物濃度低，長(zhǎng)期用藥則毒副作用增加[2]，在一定程度上影響了阿苯達(dá)唑的抗包蟲的作用。本研究將阿苯達(dá)唑制成前體膠束制劑(ZL200610200344.2)，通過(guò)增加阿苯達(dá)唑的溶解度來(lái)提高阿苯達(dá)唑的體內(nèi)吸收，增加其生物利用度，并利用其納米特性使其具有一定的靶向性。阿苯達(dá)唑前體膠束在使用前為一無(wú)水的均勻混合物,由于使用前不是以膠束形式存在，只在使用或口服時(shí)才形成膠束，因而不存在微粒給藥劑型普遍存在的物理穩(wěn)定性問(wèn)題。阿苯達(dá)唑前體膠束水化后的包封率是阿苯達(dá)唑前體膠束質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中比較重要一項(xiàng)內(nèi)容。但目前還沒(méi)有一種比較公認(rèn)行之有效的測(cè)定前體膠束水化后的包封率方法，本研究采用葡聚糖凝膠過(guò)濾法分離膠束與游離藥物，使用HPLC法測(cè)定阿苯達(dá)唑前體膠束的包封率，獲得了較好效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試劑UV-2550島津紫外可見分光光度計(jì)(日本)，BP211D Sarturius電子天平(美國(guó))，Waters Alliance2695/2487高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó))，電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，高速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。阿苯達(dá)唑前體膠束(實(shí)驗(yàn)室自制批號(hào)：060530-1、060530-2、060530-3)，阿苯達(dá)唑原料藥(廣西桂林制藥廠，批號(hào)：20040301)，阿苯達(dá)就唑標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100373-200301)，sephdexG-50(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，粒度100～300 μm)，硝酸鉀、冰乙酸、無(wú)水乙醇、三乙胺、磷酸均為分析醇，甲醇、乙腈均為色譜醇，水為重蒸餾水。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱ODS C18柱(150 mm×3.9 mm,5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶三乙胺-磷酸緩沖液(24∶20∶56)，檢測(cè)波長(zhǎng)295 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 三乙胺-磷酸緩沖液的配制 精密吸取三乙胺35.68 mL，加入1 600 mL重蒸水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，置2 000 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，備用。

2.1.3 貯備液的配制 精密稱取阿苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)品4 mg置2 mL 容量瓶中，加入冰乙酸溶解，用甲醇稀釋至刻度，得到2 mg/mL的貯備液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取阿苯達(dá)唑貯備液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制濃度為4、8、12、16、20 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)液，分別進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以峰面積對(duì)濃度回歸，得回歸方程：A=48 259C+1 249.3，r2=0.999 8，線性范圍：4～20 μg/mL，4、12、20 μg/mL的RSD值分別為3.9%、0.85%、2.5%(n=5)。

2.1.5 回收率試驗(yàn) 按處方劑量配制空白前體膠束，精密稱取樣品量的空白前體膠束于10 mL容量瓶中，加冰乙酸溶解，加甲醇稀釋至刻度，再吸取0.1 mL溶液置10 mL容量瓶中，分別加入0.02、0.06、0.1 mL貯備液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得4、12 、20 μg/mL的含輔料標(biāo)準(zhǔn)液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成實(shí)際測(cè)定濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果回收率分別為95.75%、98.11%、97.62%，RSD分別為3.27%、0.30%、1.49%(n=5)。

2.2阿苯達(dá)唑前體膠束包封率的測(cè)定

2.2.1 葡聚糖凝膠的洗脫曲線測(cè)定 取12 h被溶脹的sephdexG-50裝柱10 cm，上樣量為0.5 mL，流速為1 mL/min,用水洗脫。以1 mL為1個(gè)流份，收集前20 mL，共計(jì)20個(gè)流份。從收集的樣品中分別吸取0.5 mL加1 mL冰醋酸再加3 mL甲醇稀釋。采用HPLC法測(cè)定其含量，繪制阿苯達(dá)唑膠束洗脫曲線，見圖1。

圖1 阿苯達(dá)唑膠束洗脫曲線

2.2.2 阿苯達(dá)唑膠束溶液、阿苯達(dá)唑水飽和溶液通過(guò)葡聚糖凝膠的情況比較 分別配制含有相同含量的阿苯達(dá)唑膠束水化溶液、阿苯達(dá)唑水溶液。分別吸取0.5 mL上柱(高度為10 cm)，用水洗脫，流速為1 mL/min。以1 mL流份為1個(gè)點(diǎn)，收集前15 mL。然后從每一份中吸取0.2 mL加1 mL冰醋酸加3 mL甲醇稀釋，采用HPLC法測(cè)定其含量。

由于阿苯達(dá)唑前體膠束水化溶液中含有包裹藥物的膠束、以分子形式存在的游離的阿苯達(dá)唑 以及可能析出的阿苯達(dá)唑顆粒，而阿苯達(dá)唑水溶液中含有分子形式存在的游離的阿苯達(dá)唑以及阿苯達(dá)唑顆粒。由阿苯達(dá)唑前體膠束水化溶液、阿苯達(dá)唑水溶液洗脫曲線可以看出阿苯達(dá)唑水溶液中游離的阿苯達(dá)唑被葡聚糖凝膠吸附，阿苯達(dá)唑顆粒被葡聚糖凝膠阻擋都無(wú)法通過(guò)葡聚糖凝膠柱，洗脫曲線基本為1條直線。而阿苯達(dá)唑前體膠束水化溶液中的阿苯達(dá)唑膠束可以通過(guò)葡聚糖凝膠柱，在前10 mL流份就可以基本洗脫完全，阿苯達(dá)唑膠束和游離的阿苯達(dá)唑得到很好分離(圖2)。

2.2.3 阿苯達(dá)唑前體膠束包封率的測(cè)定方法的確定 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)初步確定葡聚糖凝膠法測(cè)定阿苯達(dá)唑前體膠束方法為：稱取適量阿苯達(dá)唑前體膠束于100 mL容量瓶中，配制阿苯達(dá)唑濃度為0.05 mg/mL水化液作為樣品，取水化液0.1 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，采用HPLC法測(cè)定其含量，計(jì)算濃度C0。另取0.5 mL水化液樣品上柱，用水洗脫，流速控制為3 mL/min;接取10 mL洗脫液，取2 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，采用HPLC法測(cè)定其含量,計(jì)算濃度C1，按公式包封率 (%)= (經(jīng)柱分離的膠束含藥量/總藥量)×100%計(jì)算包封率，即包封率(%)=(C1/C0)×100%。

圖2 阿苯達(dá)唑洗脫曲線

2.2.4 阿苯達(dá)唑前體膠束包封率測(cè)定 按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定3批前體膠束(060530-1、 060530-2、060530-3)的包封率，結(jié)果包封率為76.38%～81.08%， RSD=6.81%，回收率為(92.23±3.57)%，見表1。

表1 阿苯達(dá)唑前體膠束水化后的包封率(n=3)

2.3包封率測(cè)定方法的回收率測(cè)定稱取適量阿苯達(dá)唑前體膠束于100 mL容量瓶中，配制阿苯達(dá)唑濃度為0.05 mg/mL水化液作為樣品，取0.5 mL水化液樣品上柱，用水洗脫，流速控制為1 mL/min;接取10 mL洗脫液，作為去除了游離藥物的膠束，精密吸取2 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，用HPLC來(lái)測(cè)定其含量,計(jì)算濃度C1。另取洗脫液(即去除了游離藥物的膠束)2 mL上柱，用水洗脫，流速控制為1 mL/min;接取10 mL洗脫液，從中精密吸取2 mL于10 mL容量瓶中，2 mL冰醋酸溶解，甲醇定容，用HPLC來(lái)測(cè)定其含量,計(jì)算濃度C2。計(jì)算回收率/%=(C2/C1)×100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 方法回收率(%， n=3)

3討論

目前關(guān)于包封率測(cè)定方法很多，主要有凝膠過(guò)濾法[3]、透析法[4]、超速離心法[5]、超濾法[6]及離子交換樹脂法[7]等?？紤]到阿苯達(dá)唑前體膠束水化液中游離藥物以微粒形式存在，超速離心法和超濾法在超速離心過(guò)程中會(huì)使游離藥物和膠束同時(shí)沉淀出來(lái)，分離不開。同時(shí)采用離心法測(cè)定阿苯達(dá)唑前體膠束的包封率，離心法測(cè)定的包封率的結(jié)果較葡聚糖凝膠過(guò)濾法偏高，也驗(yàn)證了這種推測(cè)。若用透析法進(jìn)行測(cè)定，由于在大量透析液中膠束的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，導(dǎo)致藥物的泄漏，從而影響包封率。高曉黎等[3]研究顯示，粒徑為100～300 μm的Sephadex G-50最適于脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)采用100～300 μm 的Sephadex G-50及粒徑較小的Sephadex G-20葡聚糖凝膠將游離阿苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑膠束分離，Sephadex G-50的分離效果較佳，再采用HPLC法測(cè)定阿苯達(dá)唑前體膠束的包封率可以有效去除輔料的干擾，方法可行，重復(fù)性較好，結(jié)果準(zhǔn)確,可以作為阿苯達(dá)唑前體膠束質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的辦法。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，洗脫曲線上僅明顯有1個(gè)峰，此峰為阿苯達(dá)唑膠束峰。游離藥物被葡聚糖凝膠吸附，較難被洗脫下來(lái)。所以葡聚糖凝膠在使用3～5次后就該更換，否則對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響。

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