袁 斌，周岐新（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，重慶市400016）

產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性桿菌重要耐藥機(jī)制之一。AmpC酶與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）作為當(dāng)前最具臨床意義的β-內(nèi)酰胺酶，具有極高的研究?jī)r(jià)值。有學(xué)者將細(xì)菌同時(shí)產(chǎn)生質(zhì)粒型AmpC酶和ESBLs定義為超-超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（SSBLs）[1]。我們通過(guò)三維試驗(yàn)檢測(cè)在川東北地區(qū)是否也存在同時(shí)產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶和ESBLs的高度耐藥菌株，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)確定AmpC酶與ESBLs基因型，建立一種可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)產(chǎn)SSBLs方法，指導(dǎo)臨床合理用藥，防止產(chǎn)SSBLs株的區(qū)域性流行。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株

收集自2008年1月－2009年6月從川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床分離革蘭陰性桿菌237株（非同一患者同一部位重復(fù)分離）。所有菌株均經(jīng)過(guò)法國(guó)生物梅里埃公司的Vitek 32全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603為ESBLs陽(yáng)性對(duì)照菌，由四川抗菌素工業(yè)研究所提供；陰溝腸桿菌029M為AmpC酶陽(yáng)性對(duì)照菌，E.coli C600為川北醫(yī)學(xué)院藥理教研室李萇清博士惠贈(zèng)。

1.2 試劑

氨芐西林（AMP）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，頭孢西?。‵OX）購(gòu)自海南輕騎海藥股份有限公司，頭孢曲松（CRO）購(gòu)自上海新先鋒藥業(yè)有限公司，氨曲南（AZ）購(gòu)自重慶圣華曦藥業(yè)，阿米卡星（AMK）購(gòu)自江蘇吳中實(shí)業(yè)股份有限公司，亞胺培南（IMP）購(gòu)自默沙東制藥有限公司，頭孢他啶（CAZ）、頭孢哌酮（CPZ）、頭孢噻肟（CTX）和頭孢哌酮/舒巴坦（CPZ/SB）由哈藥集團(tuán)制藥總廠提供，哌拉西林（PIP）購(gòu)自齊魯制藥廠，頭孢吡肟（FEP）購(gòu)自施貴寶制藥有限公司，左氧氟沙星（LEV）購(gòu)自山西威奇達(dá)藥業(yè)有限公司，哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TZ）購(gòu)自珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，克拉維酸（CA）、氯唑西林（CLO）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；頭孢噻肟紙片（30 μg/片）購(gòu)于北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；PCR反應(yīng)系統(tǒng)（天根生化科技有限公司）。

1.3 儀器

Sakuma MIT-P細(xì)菌多點(diǎn)接種儀（日本佐久間公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MIC實(shí)驗(yàn)

采用瓊脂二倍稀釋法，判斷標(biāo)準(zhǔn)依照2008年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)稀釋法標(biāo)準(zhǔn)作為判斷。

2.2 改良三維試驗(yàn)

采用超聲破碎法制備分離菌株β-內(nèi)酰胺酶粗提液；涂布大腸埃希菌ATCC 25922的M-H平板中央貼上CTX紙片，然后在距CTX紙片邊緣5 mm處用刀片作放射狀向外切4個(gè)裂隙（分別編號(hào)A、B、C、D），在4個(gè)裂隙中分別加入待測(cè)酶粗提液30 μL；酶粗提液30 μL+2 mmol·L－1CA溶液10 μL；酶粗提液30 μL+2 mmol·L－1CLO 溶液 10 μL；酶粗提液 30 μL+2 mmol·L－1CA 溶液 10 μL+2 mmol·L－1CLO 溶液 10 μL。37℃過(guò)夜培養(yǎng)。平板若在裂隙與CTX紙片交界處出現(xiàn)矢狀的細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)域者判為陽(yáng)性，反之則為陰性。A、C號(hào)裂隙陽(yáng)性為單產(chǎn)ESBLs；A、B號(hào)裂隙陽(yáng)性為單產(chǎn)AmpC酶；A、B、C號(hào)裂隙陽(yáng)性為同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC酶。A、B、C、D號(hào)裂隙皆為陰性則為陰性結(jié)果。

2.3 質(zhì)粒結(jié)合實(shí)驗(yàn)

以E.coli C600作為受體菌，以同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC酶的陽(yáng)性菌株作為供體菌，參考文獻(xiàn)[2]操作。

2.4 PCR法擴(kuò)增耐藥基因

堿裂法提取結(jié)合試驗(yàn)結(jié)合子的質(zhì)粒DNA，以其為模板，參考文獻(xiàn)[3，4]，擴(kuò)增編碼ESBLs的基因SHV、TEM、CTX-M、OXA；擴(kuò)增編碼 AmpC 酶的基因 MOX、CIT、DHA、ACC、FOX、ACT。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

3 結(jié)果

3.1 MIC測(cè)定結(jié)果

臨床分離革蘭陰性桿菌對(duì)抗生素耐藥率詳見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，臨床分離革蘭陰性桿菌對(duì)多種抗生素存在著較高的耐藥率，僅對(duì)IMP耐藥率較低。篩選出同時(shí)對(duì)FOX和CAZ耐藥菌株105株。

3.2 三維試驗(yàn)結(jié)果

參見(jiàn)圖1～圖4，三維試驗(yàn)得到同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC酶細(xì)菌共6株，單產(chǎn)ESBLs菌株26株，單產(chǎn)AmpC酶菌株12株。同時(shí)，未測(cè)得酶型與陰性結(jié)果也較高，分別占20.3%與10.9%（見(jiàn)表2）。

3.3 質(zhì)粒結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6株三維試驗(yàn)提示，同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC酶菌株質(zhì)粒結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2株細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)成功，分別為大腸埃希菌和陰溝腸桿菌。

3.4 PCR結(jié)果

以質(zhì)粒結(jié)合成功2株菌株結(jié)合子提取質(zhì)粒為模板，分別以通用引物SHV、CTX、ACT和TEM、CTX、ACT擴(kuò)增出陽(yáng)性結(jié)果，并與目標(biāo)條帶吻合。

4 討論

革蘭陰性桿菌是目前引發(fā)醫(yī)院感染的主要病原體，約占60%～70%[5]。革蘭陰性桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，但一致認(rèn)為，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶為革蘭陰性桿菌重要的耐藥機(jī)制之一。在所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶中，又以ESBLs與AmpC酶最為主要，日益受到大家的關(guān)注。

表1 臨床分離革蘭陰性桿菌對(duì)抗生素耐藥率情況（%%）Tab 1 Drug resistance rate of clinical isolated gram-negative bacteria to antibiotics（%%）

圖1 三維試驗(yàn)陰性Fig 1 Negative producing ESBLs of three-dimensional test

圖2 三維試驗(yàn)ESBLs陽(yáng)性Fig 2 Positive producing ESBLs of three-dimensional test

圖3 三維試驗(yàn)AmpC酶陽(yáng)性Fig 3 Positive producing AmpC of three-dimensional test

圖4 三維試驗(yàn)同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC酶陽(yáng)性Fig 4 Positive producing ESBLs and AmpC of threedimensional test

表2 三維試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab 2 Results of modified three-dimensional test

ESBLs是可以水解青霉素類、頭孢菌素與單環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素的一類β-內(nèi)酰胺酶，主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，因此可在不同菌株之間轉(zhuǎn)移與傳播[6]。依據(jù)2001年Bradford分類方法[7]，可以把ESBLs分成5類：SHV型、TEM型、OXA型、CTX-M型及其他型。自ESBLs首次報(bào)道以來(lái)，目前已發(fā)現(xiàn)超200種的ESBLs[8]。AmpC酶與ESBLs不同，通常是由染色體負(fù)責(zé)編碼。自1988年發(fā)現(xiàn)了首個(gè)由質(zhì)粒介導(dǎo)的源于陰溝腸桿菌的AmpC酶以來(lái)，目前共發(fā)現(xiàn)約30種AmpC酶[9]。最近，國(guó)內(nèi)也開(kāi)始相繼出現(xiàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的報(bào)道。朱斌等[10]首次報(bào)道了在國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中存在有質(zhì)粒介導(dǎo)CMY-7型AmpC酶。王輝等[11]報(bào)道了在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)同時(shí)產(chǎn)DHA-1質(zhì)粒AmpC型及CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌。另外，在大腸埃希菌等菌種中也檢測(cè)出新型的AmpC酶亞型[12]。隨著報(bào)道的增多，由質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶在細(xì)菌之間的傳播趨勢(shì)已出現(xiàn)。

SSBLs相較ESBLs與AmpC酶，降解底物譜更加廣泛，水解率更高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)SSBLs細(xì)菌對(duì)除碳青霉烯類之外的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素全耐藥。由于β-內(nèi)酰胺酶由質(zhì)粒介導(dǎo)，其耐藥性相較染色體介導(dǎo)更易在不同菌株、菌種乃至不同菌屬中傳播，因此，其研究具有重要的流行病學(xué)價(jià)值[13]。因此，對(duì)產(chǎn)SSBLs菌株的快速、及時(shí)檢測(cè)，以及對(duì)其耐藥譜進(jìn)行分析，對(duì)于防控因其引起的院內(nèi)感染的傳播流行具有重要的指導(dǎo)意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)許多地區(qū)相繼報(bào)道有臨床分離產(chǎn)SSBLs革蘭陰性桿菌出現(xiàn)[10～20]。但未見(jiàn)本地產(chǎn)SSBLs菌株分離報(bào)道。

本研究選擇臨床分離的237株革蘭陰性桿菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行革蘭陰性桿菌臨床分離株耐藥現(xiàn)狀研究，結(jié)果表明，本地臨床分離革蘭陰性桿菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重；基于SSBLs具有水解第3代頭孢菌素與頭霉素類的特點(diǎn)，同時(shí)篩選出對(duì)CAZ與FOX 2種抗生素均耐藥的革蘭陰性桿菌105株，再經(jīng)改良三維試驗(yàn)、質(zhì)粒結(jié)合實(shí)驗(yàn)和PCR實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行篩選確證。在237株菌中發(fā)現(xiàn)2株產(chǎn)SSBLs細(xì)菌，表明本地存在產(chǎn)SSBLs革蘭陰性桿菌所引起的感染，存在此類菌株在院內(nèi)傳播流行的可能。產(chǎn)SSBLs的2株細(xì)菌均產(chǎn)生至少2類ESBLs，分別為CTX-M、TEM與CTX-M、SHV，與當(dāng)?shù)匾酝鶊?bào)道相符[21]；同時(shí)，這2株菌株的質(zhì)粒均含有產(chǎn)生ACT型AmpC酶基因。該結(jié)果表明，研究菌株產(chǎn)SSBLs菌株質(zhì)粒均編碼ACT型AmpC酶，依照不同菌屬染色體AmpC酶的同源關(guān)系判斷，該型酶屬于腸桿菌屬群，這是首次報(bào)道本地區(qū)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒編碼AmpC酶。改良三維試驗(yàn)與PCR法可用于產(chǎn)SSBLs革蘭陰性桿菌篩選與確證。

（致謝：本研究得到了川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物室在菌株收集與鑒定工作中的幫助，謹(jǐn)致謝意！）

[1] 王清濤，劉穎梅，王 輝，等.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株中質(zhì)粒頭孢菌素酶的研究[J].中華內(nèi)科雜志，2004，43（7）：487.

[2] 郭遠(yuǎn)瑜，魏澤慶，朱佩瓊，等.產(chǎn)多種β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的基因型研究[J].中華臨床感染病雜志，2010，3（3）：138.

[3] Yao F，Qian Y，Chen S，et al.Incidence of extended-spectrum β-lactamases and characterization of integrons in extended-spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolated in Shantou，China[J].Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2007，39（7）：527.

[4] Pérez-Pérez FJ，Hanson ND.Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR[J].J Clin Microbiol，2002，40（6）：2 153.

[5] 吳安華，任 南，文細(xì)毛，等.醫(yī)院內(nèi)感染非發(fā)酵革蘭陰性桿菌的病原學(xué)與耐藥性監(jiān)測(cè)研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（11）：764.

[6] Thomson KS.Controversies about extended-spectrum and AmpC β-lactamases[J].Emerg Infect Dis，2001，7（2）：333.

[7] Bradford PA.Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century：characterization，epidemiology，and detection of this important resistance threat[J].Clin Microbiol Rev，2001，14（4）：933.

[8] Jacoby GA，Munoz-Price LS.The new β-lactamases[J].N Engl J Med，2005，352（4）：380.

[9] Philippon A，Arlet G，Jacoby GA.Plasmid-determined Amp-C-type β-lactamases[J].Antimicrob Agents Chemother，2002，46（1）：1.

[10] 朱 斌，吳安華，張 平，等.銅綠假單胞菌質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶耐藥性的分子生物學(xué)研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（8）：905.

[11] 王 輝，劉穎梅，王清濤，等.北京發(fā)現(xiàn)同時(shí)產(chǎn)DHA-1質(zhì)粒AmpC型及CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2005，25（5）：419.

[12] 王 謙，陳 燕，程 君，等.產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌的耐藥性及相關(guān)耐藥機(jī)制[J].中國(guó)抗生素雜志，2008，33（2）：106.

[13] 孫宏莉，寧永忠，廖 康，等.全國(guó)10所教學(xué)醫(yī)院產(chǎn)ESBLs和質(zhì)粒AmpC酶大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌的研究[J].中國(guó)感染與化療雜志，2007，7（5）：323.

[14] 沈定霞，羅燕萍，曹敬榮，等.肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006，16（8）：850.

[15] 虞 濤，李長(zhǎng)振，鮑連生，等.武漢市兒童醫(yī)院臨床分離大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌中產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶和ESBLs的研究[J].中國(guó)感染與化療雜志，2008，8（6）：448.

[16] 周 強(qiáng)，鄧晨暉，張 文，等.重癥監(jiān)護(hù)病房產(chǎn)ESBLs、p-AmpC酶和SSBL肺炎克雷伯菌檢出率及耐藥性研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38（7）：882.

[17] 葉 英，李家斌，余鑫之，等.銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌超超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15（3）：157.

[18] 胡龍華，余方友，鄒葉青，等.大腸埃希菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的基因型檢測(cè)[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2006，24（5）：393.

[19] 張永標(biāo)，張扣興，唐英春，等.產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶和ESBLs細(xì)菌的耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶基因型研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24（7）：577.

[20] 姜梅杰，馮 莉，趙書(shū)平，等.產(chǎn)ESBLs與質(zhì)粒AmpC酶肺炎克雷伯菌的耐藥性及基因型研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18（8）：1 061.

[21] 余 嫻，凌保東，雷 軍.某院產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶臨床分離革蘭陰性桿菌的耐藥性及基因型分析[J].中國(guó)藥房，2007，18（1）：25.