Mel-18在前列腺癌中的臨床意義

王 尉 胡衛(wèi)列 呂 軍 聶海波 邱曉拂 趙永斌 肖遠(yuǎn)松 劉 俊

最近研究表明，Mel-18 可能是1種新的抑癌基因。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)Mel-18 表達(dá)于正常乳腺組織，而在乳腺癌原代標(biāo)本中低表達(dá)或不表達(dá)，Guo 等[1～5]認(rèn)為增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞Mel -18 的表達(dá)，可降低乳腺癌細(xì)胞Akt/ PKB 的活性。盡管在人類許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Mel-18基因的異常，但目前國(guó)內(nèi)、外尚鮮見Mel-18 與前列腺癌關(guān)系的報(bào)道。它與前列腺癌分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間是否存在相關(guān)關(guān)系；能否成為前列腺癌診斷及預(yù)后判斷的標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，仍不十分明確。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

前列腺癌標(biāo)本取自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科收治的前列腺癌患者，免疫組織化學(xué)采用辣根過(guò)氧化物酶法染色。

對(duì)廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科收治的202例前列腺癌患者病理組織標(biāo)本進(jìn)行Mel-18免疫組織化學(xué)染色。患者的臨床病理參數(shù)見表1。這些患者在前列腺癌確診前未接受過(guò)內(nèi)分泌等前列腺癌相關(guān)性治療，通過(guò)TNM 分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床及病理分期。自1997年至2003年期間，對(duì)76例接受根治性前列腺切除的局限性前列腺癌患者，進(jìn)行生存分析，生存參數(shù)包括Gleason評(píng)分，包膜外浸潤(rùn)、精囊受累、外科切緣、Mel-18染色強(qiáng)度等。對(duì)126例未接受根治性前列腺切除術(shù)的前列腺癌患者，包括61例伴骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者進(jìn)行生存分析，病理組織取自前列腺穿刺活檢樣品，通過(guò)X線、CT、MRI 及骨掃描明確轉(zhuǎn)移情況。

76例接受根治性前列腺切除的局限性前列腺癌患者，平均年齡為(70.2±5.1)歲，平均隨訪時(shí)間為(36.3±22.8)月，術(shù)前平均血TPSA為(17.0±14.9)ng/ ml。病理分期T2、T3及T4分別為58.8％，34.7％ 及 6.5％。陽(yáng)性切緣率為43.9％。Gleason評(píng)分<7、 7 及 >7 分別為20.7％、 43.0％ 及 36.3％。3年及 5年 PSA 無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為66.8％ 及 61.6％,中位隨訪時(shí)間為58.1個(gè)月。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)采用辣根過(guò)氧化物酶法染色[6]。Mel-18 單抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司(C20， USA)。

①主要步驟：切片用二甲苯脫蠟，梯度酒精和蒸餾水水化。3％H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶20 min，自來(lái)水沖洗， 0.01 mol/L(pH7.4)洗。滴加一抗37℃孵育40 min， 4℃冰箱過(guò)夜PBS洗3次×5 min。滴加二抗37℃孵育40 min， PBS洗3次×5 min。滴加ABC試劑孵育60 min。PBS洗3次×5min。置0.03％ H2O2-DAB 溶液顯色20 min，自來(lái)水洗，蒸餾水洗。蘇木精復(fù)染2 min或不復(fù)染，自來(lái)水洗。脫水，透明，封片。陰性對(duì)照以TBS 取代一抗。一抗Mel -18使用濃度為1∶400。②結(jié)果判定：Mel-18陽(yáng)性表達(dá)集中在細(xì)胞核， 表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒。③按半定量積分判斷Mel-18蛋白表達(dá)結(jié)果， Mel-18陽(yáng)性染色細(xì)胞呈黃色至棕黃色、棕褐色顆粒。陽(yáng)性染色強(qiáng)度分為1～4級(jí)，1級(jí):陰性，細(xì)胞核不著色或無(wú)顆粒；2級(jí):輕度陽(yáng)性，細(xì)胞核呈均勻淺黃色或有極少量顆粒;3級(jí):中度陽(yáng)性，細(xì)胞核呈棕黃色，顆粒占整個(gè)細(xì)胞核的1 /2;4級(jí):重度陽(yáng)性，細(xì)胞核中充滿棕褐色顆粒。Mel-18陽(yáng)性染色密度(即陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率)亦分為1～4級(jí)， 1級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0～5％， 2級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)6％～35％， 3級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)36％～70％， 4級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)71％～100％。為了比較組織間Mel-18表達(dá)水平的差異，每一組織切片的表達(dá)水平均以陽(yáng)性染色總積分表示，總積分=該組織切片的陽(yáng)性染色強(qiáng)度(1～4)×陽(yáng)性染色密度(1～4)。依據(jù)總積分值，將Mel-18蛋白在組織中的表達(dá)水平分為陽(yáng)性或陰性，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)，<4分為陰性表達(dá)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用Logistic回歸分析法調(diào)整年齡，評(píng)價(jià)Mel-18蛋白與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、病理高分級(jí)的相關(guān)性。PSA復(fù)發(fā)定義為根治性手術(shù)后大于0.2 ng/ml。使用Kaplan-Meier生存分析和單變量Cox成比例危險(xiǎn)因子模型(univariate cox proportional harzards model)，評(píng)價(jià)影響患者無(wú)PSA復(fù)發(fā)生存率、癌特異性生存率及總生存率的的個(gè)體變量。除Mel-18蛋白表達(dá)量外，其他變量包括Gleason評(píng)分，術(shù)前PSA、Hb、LDH、AKP，腫瘤分期、病理分級(jí)和手術(shù)切緣情況。為同時(shí)評(píng)價(jià)包括Mel-18蛋白表達(dá)量對(duì)幾個(gè)變量的影響，使用多變量Cox比例危險(xiǎn)模型(multivariate Cox proportional harzards model)，用Wald’s檢驗(yàn)決定單變量和多變量Cox模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯著性水準(zhǔn)為0.05。數(shù)據(jù)在SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包上完成。

2 結(jié)果

2.1 Mel-18表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系

前列腺癌組織中Mel-18 免疫組織化學(xué)染色分析表明，高Gleason 評(píng)分的癌組織較低Gleason 評(píng)分的癌組織染色強(qiáng)度降低。各組間染色分析結(jié)果表明：PSA≥100.1組較其它PSA組別染色陽(yáng)性率減少(P=0.010)；T2N0M0組較其它分期組別染色陽(yáng)性率增多(P=0.021)；Gleason評(píng)分8～10組較Gleason評(píng)分5～6組染色陽(yáng)性率降低(P=0.031)；Gleason評(píng)分9,10組較Gleason評(píng)分5～8染色陽(yáng)性率降低(P=0.026)(表1)。運(yùn)用多變量Cox成比例危險(xiǎn)因子模型(multivariate cox proportional hazards model)分析表明：陰性Mel-18的染色結(jié)果是伴生化復(fù)發(fā)或前列腺癌特異性生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(OR:2.143,95％CI:1.035～4.132；OR:2.365,95％CI:1.194～5.485)(表2，表3)。

2.2 Mel-18表達(dá)與生存情況的關(guān)系

按Mel-18染色結(jié)果分組進(jìn)行生存分析，生存曲線分析表明：Mel-18陰性染色組較Mel-18陽(yáng)性染色組，在PSA復(fù)發(fā)時(shí)間顯著縮短(P=0.029)(圖1A)，初診為D期的患者的癌特異性生存時(shí)間顯著縮短(P=0.025)(圖1B)。

表1 Mel-18表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 多變量Cox成比例危險(xiǎn)因子模型分析伴前列腺癌生化復(fù)發(fā)生存的預(yù)測(cè)因素

表3 多變量Cox成比例危險(xiǎn)因子模型分析前列腺癌特異性生存的預(yù)測(cè)因素

注：1 HR:hazard ratio,2 CI:confidence interval

圖1 Mel-18染色情況分層的Kaplan-Meier 生存曲線分析

3 討論

前列腺癌是西方國(guó)家男性最常見的惡性腫瘤之一，居男性癌癥死因的第二位。過(guò)去，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率較低，但隨著人均壽命的延長(zhǎng)、膳食結(jié)構(gòu)的改變及診斷技術(shù)的進(jìn)步，其發(fā)病率在逐年提高，已躍居為男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位[8]。然而到目前為止，導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生與進(jìn)展的分子遺傳學(xué)因素尚未完全清楚，因此，從前列腺癌的發(fā)病機(jī)理出發(fā)，在分子水平對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行研究，對(duì)于前列腺癌的診治及預(yù)防具有重要的意義。

病理學(xué)分級(jí)及臨床分期對(duì)前列腺癌的預(yù)后評(píng)價(jià)存在一定的局限性。腫瘤細(xì)胞的某些基因及其表達(dá)產(chǎn)物在腫瘤中的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。癌基因激活和抑癌基因失活是各種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。抑癌基因是一類抑制細(xì)胞增殖及癌變的基因，同時(shí)也是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和分化的正?；颍职┗虻氖Щ顣?huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。目前，對(duì)腫瘤抑制基因的研究是基因治療腫瘤的1個(gè)研究熱點(diǎn)。

多梳基因( polycomb group genes， PcG)家族作為核蛋白家族之一，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中有著重要的作用[9]。Bmi-1是PcG家族中研究較多的蛋白之一，已在多種實(shí)體腫瘤中證實(shí)為原癌基因產(chǎn)物[10～12]，Bmi-1的過(guò)度表達(dá)與前列腺癌等腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及進(jìn)展密切相關(guān)[13，14]。Mel-18(PcG RING finger protein 2，PCGF2)，在N端區(qū)域?yàn)殇\指區(qū)域，該區(qū)域與Bmi-1相應(yīng)區(qū)域有93％同源性[15]。c-Myc位于染色體8q24，通過(guò)調(diào)控雄激素受體通路在前列腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用，Bmi-1與原癌基因c-Myc有協(xié)同致癌作用。有研究表明，Mel-18通過(guò)抑制Bmi-1及c-My發(fā)揮腫瘤抑制物的作用。最近的泛基因組分析表明，8q24，17q12，及17q24.3與前列腺癌相關(guān)[16,17]，Mel -18 位于染色體17q12，該區(qū)域通過(guò)基因連鎖和相關(guān)性檢驗(yàn)證實(shí)與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。最近研究表明，Mel -18是1種新的抑癌基因，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)Mel -18 表達(dá)于正常乳腺組織，而在乳腺癌原代標(biāo)本中低表達(dá)或不表達(dá)。Lee等認(rèn)為增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞Mel -18 的表達(dá)，可降低乳腺癌細(xì)胞Akt/ PKB 的活性，通過(guò)INK4a/ARF基因抑制細(xì)胞周期進(jìn)入增殖期，轉(zhuǎn)錄抑制原癌基因Bmi-1和c-Myc，從而發(fā)揮抵制腫瘤的作用[1～5]。

我們研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中Mel-18 免疫組織化學(xué)染色分析表明，高分級(jí)的癌組織較低分級(jí)癌組織染色強(qiáng)度降低。陰性Mel-18的染色結(jié)果是伴生化復(fù)發(fā)或前列腺癌特異性生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。研究結(jié)果證實(shí)，Mel-18與前列腺癌進(jìn)展為負(fù)相關(guān)，與上述文獻(xiàn)在其他腫瘤中的抑制作用一致，可能發(fā)揮著抑制前列腺癌進(jìn)展的作用。

[1]Kanno M,Hasegawa M,Ishida A,et al.mel-18,a Polycomb group-related mammalian gene,encodes a transcriptional negative regulator with tumor suppressive activity〔J〕.EMBO J ,1995,14(22):5672.

[2]Silva J,García JM,Pea C,et al.Implication of polycomb members Bmi-1,Mel-18,and Hpc-2 in the regulation of p16INK4a,p14ARF,h-TERT,and c-Myc expression in primary breast carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res,2006,12(23):6929.

[3]Guo WJ,Zeng MS,Yadav A,et al.Mel-18 acts as a tumor suppressor by repressing Bmi-1 expression and down-regulating Akt activity in breast cancer cells〔J〕.Cancer Res,2007,67(11):5083.

[4]Guo WJ,Datta S,Band V,et al.Mel-18,a polycomb group protein,regulates cell proliferation and senescence via transcriptional repression of Bmi-1 and c-Myc oncoproteins〔J〕.Mol Biol Cell,2007,18(2):536.

[5]Wang W,lin,TX,Huang J,et al.Analysis of Mel-18 expression in prostate cancer tissues and correlation with clinicopathologic features〔J〕.Urol Oncol，2009，Apr，21.[Epub ahead of print].

[6]Nogawa M,Yuasa T,Kimura S,et al.Intravesical administration of small interfering RNA targeting PLK-1 successfully prevents the growth of bladder cancer〔J〕.J Clin Invest,2005,115(4):978.

[7]Guo WJ,Zeng MS,Yadav A,et al.Mel-18 acts as a tumor suppressor by repressing Bmi-1 expression and down-regulating Akt activity in breast cancer cells〔J〕.Cancer Res,2007,67(11):5083.

[8]吳階平.吳階平泌尿外科學(xué)〔M〕.第1版.北京:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2004:1059.

[9]Sparmann A,van Lohuizen M.Polycomb silencers control cell fate,development and cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2006,6(11):846.

[10]Raaphorst FM.Self-renewal of hematopoietic and leukemic stem cells:a central role for the Polycomb-group gene Bmi-1〔J〕.Trends Immunol,2003,24(10):522.

[11]Dirks P.Bmi1 and cell of origin determinants of brain tumor phenotype〔J〕.Cancer Cell,2007,12(4):295.

[12]Glinsky GV.“Stemness”genomics law governs clinical behavior of human cancer:implications for decision making in disease management〔J〕.J Clin Oncol,2008,26(17):2846.

[13]Glinsky GV,Berezovska O,Glinskii AB.Microarray analysis identifies a death-from-cancer signature predicting therapy failure in patients with multiple types of cancer〔J〕.J Clin Invest ,2005,115(6):1503.

[14]Mohty M,Yong AS,Szydlo RM,et al.The polycomb group BMI1 gene is a molecular marker for predicting prognosis of chronic myeloid leukemia〔J〕.Blood,2007,110(1):380.

[15]Goebl MG.The bmi-1 and mel-18 gene products define a new family of DNA-binding proteins involved in cell proliferation and tumorigenesis〔J〕.Cell ,1991,66(4):623.

[16]Zheng SL,Sun J,Wiklund F,et al,Bleecker ER,et al.Cumulative association of five genetic variants with prostate cancer〔J〕.N Engl J Med,2008,358(9):910.

[17]Sun J,Chang BL,Isaacs SD,et al.Cumulative effect of five genetic variants on prostate cancer risk in multiple study populations〔J〕.Prostate,2008,68(12):1257.