王俊艷綜述 魏素菊審校

隨著人們對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究，乳腺癌干細(xì)胞日益受到研究者們的重視。研究表明，乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌組織中極少數(shù)具自我更新和多向分化能力的細(xì)胞,與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這些細(xì)胞具有化療、放療及缺氧抵抗性，同時(shí)具有高致瘤性、高侵襲轉(zhuǎn)移性，在乳腺癌的發(fā)生﹑發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移﹑復(fù)發(fā)中起著極其重要作用。本文對乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌研究及治療中的最新進(jìn)展作一綜述。

1 乳腺癌干細(xì)胞的鑒定和分離

以往的研究證實(shí)腫瘤干細(xì)胞應(yīng)具備以下特性[1]:①少量乃至單個細(xì)胞即可在免疫缺陷鼠中形成新的腫瘤；②所生成的子代腫瘤具有異質(zhì)性,既包含癌干細(xì)胞也包含一般癌細(xì)胞;③子代腫瘤需包含“源腫瘤”所有表型及遺傳特征。

1.1 ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、Lin-細(xì)胞

2003年AI-Hajj等[2]將ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、L in-細(xì)胞注入到非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠NOD /SC ID體內(nèi),12周內(nèi)小鼠均出現(xiàn)腫瘤,而接種CD44- 或CD24+細(xì)胞的小鼠則少有腫瘤生長。生成的腫瘤細(xì)胞經(jīng)分離再接種到小鼠乳房脂肪墊中,未分類細(xì)胞需接種5×104個才能形成腫瘤,而ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、Lin- 細(xì)胞只需接種1 ×103個即能100％形成腫瘤,這說明表達(dá)ESA+ 、CD44+ 、CD24- / low、L in- 表面標(biāo)記的細(xì)胞亞群在乳腺癌中起著干細(xì)胞樣作用。Ponti等[3]體外培養(yǎng)Oct4+及CD44+/CD24- 的人乳腺癌細(xì)胞,可產(chǎn)生分別具有腔上皮與肌上皮標(biāo)記的2種癌細(xì)胞后代。Gabriella等[4]發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24- 細(xì)胞在基底樣乳腺癌和BRCA1遺傳性乳腺癌中常見,其中94％遺傳性乳腺癌含有 CD44+/ CD24 - 細(xì)胞,可見該群細(xì)胞在乳腺癌的發(fā)生中發(fā)揮著干細(xì)胞樣作用。

1.2 乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)

ALDH 是細(xì)胞內(nèi)的一組同工酶,在干細(xì)胞分化早期起著使視黃醇氧化成視黃酸的作用,ALDH1是ALDH家族的主要成員[5]。Ginestier等[6]利用ALDEFLOUR試劑檢測細(xì)胞內(nèi)ALDH活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺組織的正常細(xì)胞以及癌細(xì)胞中ALDEF- LOUR陽性細(xì)胞均具有類似干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力,而陰性細(xì)胞則不然。500個ALDEFLOUR 陽性乳腺癌細(xì)胞異種移植到去除乳腺的NOD /SCID 小鼠乳房脂肪墊中,就能形成腫瘤,而且能夠分化形成ALDEFLOUR 陰性細(xì)胞。ALDEFLOUR 陽性細(xì)胞群和CD44+ /CD24- /Lin- 細(xì)胞群有部分重疊,至少20 個表型為CD44+ /CD24- /Lin- /ALDEFLOUR陽性細(xì)胞即能形成腫瘤。Charafe-Jauffret等[7]利用相同方法分離和標(biāo)記出ALDEFL OUR陽性乳腺癌細(xì)胞株,將其異種移植到NOD /SCID小鼠中可以形成腫瘤,而且由ALDEFLOUR陽性細(xì)胞形成的腫瘤中ALDEFLOUR陽性細(xì)胞與ALDEFLOUR陰性細(xì)胞的比例與其在細(xì)胞株中的比例相似。此外,在造血細(xì)胞、胰腺癌和肺癌等多種組織中ALDH1高表達(dá)[ 8，9 ],ALDH1有望成為分離和鑒別多種干細(xì)胞的共同標(biāo)志。

1.3 側(cè)群細(xì)胞( sidepopulation,SP)

Hoechst33342 是DNA 增補(bǔ)性染料,能結(jié)合DNA的AT豐富系列的小溝處,干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞因帶有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而能將染料泵出細(xì)胞,經(jīng)過熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)( fluorescence activated cell sorter,FACS)的分析,將不被染色或低染色的腫瘤干細(xì)胞篩選出來,所分選出來的染色暗淡的細(xì)胞被稱為側(cè)亞群細(xì)胞,故又稱為側(cè)群細(xì)胞分選法。Patrawala等[10 ]將從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中分離得到的SP細(xì)胞移植到NOD /SC ID小鼠,移植1000個SP細(xì)胞時(shí),17％的小鼠形成腫瘤;移植1×104個SP細(xì)胞時(shí)50％的小鼠形成腫瘤,腫瘤形成的潛伏期隨著移植SP細(xì)胞數(shù)量的增多而縮短,機(jī)制可能與SP細(xì)胞高表達(dá)Notch21和β2catenin分子有關(guān)。同時(shí)SP亞群可傳代并生成其他非SP細(xì)胞,顯示其具有自我更新和多向分化能力,提示有腫瘤干細(xì)胞特性。Engelmann等[11]發(fā)現(xiàn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞中大多數(shù)SP細(xì)胞表型為CD44+ /CD24- / low；77.8％的SP細(xì)胞表達(dá)MUC1 ,因此以MUC1腫瘤抗原為治療靶標(biāo)可以消除腫瘤干細(xì)胞,為乳腺癌的治療提供新的方案。

1.4 乳腺球(mammospheres)

乳腺上皮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)有一小群細(xì)胞可在不貼壁條件下形成一些漂浮的球形克隆,稱乳腺球(mammospheres)。Ponti等[3]利用此方法從乳腺癌細(xì)胞中制備乳腺球,發(fā)現(xiàn)其中大部分細(xì)胞表達(dá)CD44+CD24-表型。與乳腺癌細(xì)胞相比,千倍稀釋的乳腺球仍可在小鼠中形成腫瘤。這些乳腺球經(jīng)酶分解后,10％～20％的細(xì)胞即可形成第2代乳腺球,其后培養(yǎng)傳承40代,證明其具有自我更新能力,是一群富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞。

1.5 標(biāo)記滯留細(xì)胞

溴脫氧尿嘧啶核苷( bromodeoxyuridine,BrdU)是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物,通過競爭摻入到S期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列中替代胸腺嘧啶。BrdU在細(xì)胞培養(yǎng)過程中或經(jīng)活體注射加入后,利用抗BrdU單克隆抗體進(jìn)行化學(xué)染色,顯示增殖細(xì)胞。如果細(xì)胞迅速分裂,BrdU就會因?yàn)楸幌♂尪鴻z測不到；如果細(xì)胞分裂緩慢,就能被檢測到,這種細(xì)胞被稱為標(biāo)記滯留細(xì)胞,故該方法可以用來鑒別和定位腫瘤干細(xì)胞[12]。但乳腺癌干細(xì)胞周期似乎不斷循環(huán),而且并不是所有的干細(xì)胞都具有滯留標(biāo)記,滯留標(biāo)記的細(xì)胞并不一定是干細(xì)胞。因此,在乳腺癌干細(xì)胞循環(huán)周期尚未探明之前,該標(biāo)志物的使用有待于進(jìn)一步研究。

然而,細(xì)胞表型僅僅是鑒定和分離細(xì)胞的標(biāo)記和手段,并不等于說CD44+CD24-/low ESA+Lin-的乳腺癌細(xì)胞就是乳腺癌干細(xì)胞。Al-Hajj等[2]的研究僅說明CD44+CD24-/lowESA+Lin-的細(xì)胞中富含乳腺癌干細(xì)胞。因此,欲通過細(xì)胞表面標(biāo)記或特殊培養(yǎng)方法來鑒定和分離完全的乳腺癌干細(xì)胞尚需更多的研究和探索。

2 乳腺癌干細(xì)胞與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后

2.1 乳腺癌干細(xì)胞與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移

Sheridan等[13]研究了13種乳腺癌細(xì)胞系中CD44+/CD24-細(xì)胞亞群與腫瘤侵襲、歸巢和轉(zhuǎn)移的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在CD44+/CD24-比例較高的細(xì)胞系中,與侵襲相關(guān)的基因和蛋白(IL-6、IL-8、IL-1α和UPA)的表達(dá)明顯高于CD44+/CD24-比例較低的細(xì)胞系。此研究表明,表達(dá)CD44+/CD24- 的乳腺癌細(xì)胞的含量與乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Mumcuoglu等[14]最近的研究結(jié)果顯示乳腺癌的惡性程度與CD44+/CD24-細(xì)胞群分化程度直接相關(guān)，分化越差惡性程度越高。Balic等[15]對早期乳腺癌患者的骨髓標(biāo)本進(jìn)行了研究,通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法發(fā)現(xiàn)這些骨髓標(biāo)本中存在CK+表達(dá)。所有CK+的標(biāo)本中均有表達(dá)CD44+/CD24-的細(xì)胞(33％～100％,中位值65％);而原發(fā)腫瘤中CD44+/CD24-細(xì)胞的比例不超過10％。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在早期乳腺癌骨髓播散分布的腫瘤細(xì)胞中多數(shù)具有乳腺癌干細(xì)胞的表型,與原發(fā)病灶存在明顯差異，提示早期乳腺癌患者骨髓中可能已經(jīng)存在轉(zhuǎn)移來的乳腺癌干細(xì)胞,從而導(dǎo)致治療后的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。

2.2 乳腺癌干細(xì)胞與預(yù)后

Shipitsin等[16]研究發(fā)現(xiàn),CD44+/CD24-的乳腺癌細(xì)胞基因標(biāo)志是乳腺癌患者預(yù)后差的獨(dú)立因素。Mylona等[17 ]用免疫組化雙染的方法對136例浸潤性乳腺癌的患者進(jìn)行了CD44 + /CD24 - 和CD44 - /CD24 +與乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系研究,其研究表明CD44 + /CD24 -與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及腫瘤的分級呈負(fù)相關(guān),與患者的生存率呈正相關(guān);而CD44 - /CD24 +與臨床病理分級沒有關(guān)系,與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。Ginestier等[18]研究發(fā)現(xiàn),ALDH1是乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志之一,而且是乳腺癌患者預(yù)后差的獨(dú)立因素。Zhou等[19 ]對國際12項(xiàng)已發(fā)表的研究成果進(jìn)行了meta分析，結(jié)果顯示乳腺癌患者的ALDH1 +(RR=2.83,95％ CI:2.16～3.67,P<0.001)以及 CD44+/CD24-/low(RR = 2.32,95％ CI:1.51～3.60,P<0.001)的腫瘤細(xì)胞的含量與患者的OS顯著相關(guān)。

3 乳腺癌干細(xì)胞與治療

現(xiàn)有的乳腺癌治療方法以殺死或清除一切腫瘤細(xì)胞為目的。但放、化療對存在于腫瘤中數(shù)量較少的干細(xì)胞樣細(xì)胞群療效非常有限，經(jīng)過治療后殘存的干細(xì)胞樣細(xì)胞群的增殖足以促使腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。Lindeman等[20]研究表明休眠腫瘤干細(xì)胞具有化療抵抗能力。所以研究除手術(shù)外的傳統(tǒng)治療方法對干細(xì)胞樣細(xì)胞群的作用，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)就尤為重要。

3.1 乳腺癌干細(xì)胞與化療

腫瘤干細(xì)胞具有細(xì)胞周期長、代謝慢的特點(diǎn),因此對抗有絲分裂藥物具有較高的耐受性。Piyush等[21]發(fā)現(xiàn)鹽霉素殺死乳腺癌干細(xì)胞的能力比普通的化療藥物如紫杉醇強(qiáng)100倍。與被紫杉醇處理過的腫瘤干細(xì)胞相比，經(jīng)過鹽霉素處理過的腫瘤干細(xì)胞被注入到實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)后，成瘤幾率顯著降低，且實(shí)驗(yàn)鼠腫瘤的生長速度也明顯減慢。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)乳腺癌癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過SDF-1通路而增加CD44+ CD24-細(xì)胞的含量，此通路有望成為化療藥物治療乳腺癌的新靶點(diǎn)。由于乳腺癌干細(xì)胞將化療藥物排除細(xì)胞外等多種原因而較其他癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的化療藥物耐受性，因此，增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞對化療藥物的敏感性是迫切需要解決的問題之一。

3.2 乳腺癌干細(xì)胞與放療

自腫瘤干細(xì)胞學(xué)說提出以來就有推測其對放療可能存在耐受性。Phillips等[23]將乳腺癌細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制備乳腺球和貼壁培養(yǎng),2種培養(yǎng)來源的細(xì)胞均制備成單細(xì)胞懸液,經(jīng)2 Gy劑量放射線照射后,結(jié)果顯示乳腺球來源的細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗輻射性,兩者經(jīng)照射后中位存活率相差近20％。同時(shí)Phillips等體外研究還表明,MCF-7細(xì)胞經(jīng)放療后乳腺癌干細(xì)胞的比例由3.5％增加到7.5％(P=0.009)。檢測與放射敏感性相關(guān)分子,如活性氧水平、組蛋白H2AX磷酸化等,乳腺球來源細(xì)胞這2種物質(zhì)均減少。分次照射后,非黏附性CD44+CD24-細(xì)胞在單細(xì)胞懸液中比例增加,提示這類細(xì)胞相對于其他細(xì)胞具有更強(qiáng)抗輻射能力。Woodward等[24]將Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠來源的乳腺細(xì)胞和β-catenin轉(zhuǎn)染的乳腺細(xì)胞經(jīng)放射線照射后發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞比例增加較對照組更明顯,且射線照射后激活的β-catenin在Lin-CD29hCD24+表型細(xì)胞中選擇性高表達(dá),提示W(wǎng)nt1和β-catenin可能調(diào)控乳腺干細(xì)胞的抗輻射能力。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了一直以來人們的1種推測,即腫瘤干細(xì)胞對放療具有抵抗性。但是這些研究還只是停留在體外實(shí)驗(yàn)上,體內(nèi)的結(jié)果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 乳腺癌干細(xì)胞與內(nèi)分泌治療

對于雌激素受體陽性的乳腺癌患者,內(nèi)分泌治療是十分重要的治療方法。因此,雌激素及各種抗雌激素藥物對激素受體陽性乳腺癌中腫瘤干細(xì)胞的影響至關(guān)重要,其最終可能決定著乳腺癌內(nèi)分泌治療的成敗。許健等[25]應(yīng)用ER陽性的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來研究雌二醇(E2)及拮抗劑他莫西芬( tamoxifen,TAM)對其中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)亞群(CD44+CD24-/low細(xì)胞)含量的影響,從腫瘤干細(xì)胞的角度來探討乳腺癌內(nèi)分泌治療的作用，從而得出不同濃度E2作用下,MCF-7中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)亞群含量增加,而在相同濃度的E2作用下,添加抗雌激素藥物TAM能夠使MCF-7中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)亞群含量降低。對于激素受體陽性的乳腺癌患者,內(nèi)分泌治療具有很好的療效。但是,內(nèi)分泌治療的作用機(jī)制十分復(fù)雜,很多尚處于探索階段。

總之，乳腺癌干細(xì)胞理論為根治乳腺癌開辟了新的治療途徑，腫瘤治療研究開始以特異性乳腺癌干細(xì)胞為主要目標(biāo)，即從源頭上根治腫瘤。發(fā)現(xiàn)和闡明乳腺癌干細(xì)胞的本身的特性，將為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)，針對乳腺癌干細(xì)胞的新一代特異性強(qiáng)的抗腫瘤生物及免疫藥物有望極大地提高腫瘤的治療效果。但到目前為止,腫瘤干細(xì)胞研究剛剛起步,仍存在諸多問題,科研工作者們也面臨著更多的挑戰(zhàn)。

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