紫杉醇誘導(dǎo)人膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡及與Bcl-2基因表達(dá)的關(guān)系

郭春龍 朱曉敏 曲世靜 姜華茂

1962年,在紫杉屬的植物提取物中，發(fā)現(xiàn)具有抗白血病和其它一些腫瘤的作用。1971年鑒定了這種提取物中具有抗癌活性的成分是紫杉醇(Paclitaxel,taxol)后，其研究日漸深入。一般認(rèn)為紫杉醇作用的靶位點(diǎn)主要是微管蛋白/微管系統(tǒng)，促進(jìn)微管聚合，抑制微管降解，使細(xì)胞分裂周期阻滯在G2/M期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1～3]。

近年來，國內(nèi)、外已有報(bào)道紫杉醇誘導(dǎo)肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病[4,5]細(xì)胞凋亡，但有關(guān)紫杉醇誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的報(bào)道目前尚少。本研究以人膀胱癌EJ細(xì)胞株為靶細(xì)胞，觀察在不同濃度的紫杉醇作用后，細(xì)胞凋亡和bcl-2基因表達(dá)的改變，探討其可能作用機(jī)制，為紫杉醇用于膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌EJ細(xì)胞株購自上海午立生物有限公司；紫杉醇注射液(規(guī)格：30 mg/5 ml，批號2004100211ED)購自上海華聯(lián)制藥有限公司； 100 bp DNA leader購自美國promega公司。

1.2 儀器設(shè)備

流式細(xì)胞儀(美國B.D公司)；熒光顯微鏡(Olympus，日本)；酶聯(lián)免疫檢測儀(DG3022A型，中國)；細(xì)胞圖像分析儀(CIAS—1000型，中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 對照組：不加入紫杉醇，每天更換RPMI-1640培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組：紫杉醇濃度分別為1、10、100、1 000 nmol/L。接種細(xì)胞24 h進(jìn)入對數(shù)生長期后開始加藥，每天換液以維持藥物濃度恒定。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測 采用PI單染法[6],對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀上樣分析，激發(fā)波長488 nm紅色熒光，測定各期細(xì)胞DNA含量及細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 bcl-2原位雜交檢測 取對數(shù)生長期的膀胱癌EJ單細(xì)胞懸液5×105個,接種于含有載玻片的底面積為8 cm2的培養(yǎng)皿中。24 h后更換培養(yǎng)液，并加處理因素，培養(yǎng)48 h。用0.1MPBS(pH7.4)洗2 min×3次。針對人bcl-2靶基因進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，于細(xì)胞圖像分析儀下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

不同濃度的紫杉醇作用24、48 h后，對EJ細(xì)胞作用結(jié)果見表1、圖1、圖2。

表1 紫杉醇作用后EJ細(xì)胞的凋亡情況(n=5,±s，％)

表1 紫杉醇作用后EJ細(xì)胞的凋亡情況(n=5,±s，％)

組別凋亡率24h48h對照組2．15±0．392．37±0．40紫杉醇1nmol/L2．78±0．452．88±0．49紫杉醇10nmol/L4．88±0．89??6．43±0．57??△紫杉醇100nmol/L10．22±1．23??15．36±1．33??△△紫杉醇1000nmol/L18．11±1．59??28．08±1．39??△△

注：與對照組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與作用24 h比較，△為P<0.05，△△為P<0.01

由表1可見，紫杉醇濃度為1 nmol/L時(shí)，與對照組比較細(xì)胞凋亡率無顯著性差異，隨作用時(shí)間延長細(xì)胞凋亡率也無顯著性差異。紫杉醇濃度>10 nmol/L以上時(shí),與對照組比較,細(xì)胞凋亡率有顯著性差異，且隨作用時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率也明顯增高。

圖1 不同濃度紫杉醇作用24 h時(shí)的流式細(xì)胞儀結(jié)果

圖2 100 nmol/L紫杉醇不同作用時(shí)間的流式細(xì)胞儀結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測DNA圖上出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞二倍體峰，為細(xì)胞凋亡峰，峰下面積即為細(xì)胞凋亡率，圖1A為對照組的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，可見未加紫杉醇的EJ細(xì)胞也有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡，由圖1中可以看出正常生長狀態(tài)下的EJ細(xì)胞大多數(shù)處于G1期，S期次之，G2/M期最少。紫杉醇>10 nmol/L以上組細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，隨著紫杉醇濃度的增加，G2/M峰逐漸增高，另外，G1期前出現(xiàn)多個因壞死所致低平小峰，且低平小峰隨紫杉醇作用時(shí)間延長而增多增高，但無論作用時(shí)間如何延長都不會出現(xiàn)凋亡峰。圖1顯示，紫杉醇作用時(shí)間相同的情況下，細(xì)胞凋亡峰隨紫杉醇濃度的增大而增高。圖2為紫杉醇濃度為100 nmol/L時(shí)分別作用24 h和48 h，細(xì)胞凋亡峰均較高，說明紫杉醇濃度為100 nmol/L時(shí)能明顯誘導(dǎo)EJ細(xì)胞凋亡，且由圖可直觀看出48 h的凋亡峰要高于24 h，說明紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有時(shí)間依賴性。

2.2 bcl-2原位雜交檢測結(jié)果

bcl-2基因表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色，紫杉醇作用后EJ細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)著色變淺，bcl-2基因在胞質(zhì)中的表達(dá)明顯減弱。

應(yīng)用細(xì)胞圖像分析儀，在每個濃度組隨機(jī)選取15個細(xì)胞，在每個高倍視野(×400倍)下測細(xì)胞的面積、圓形度和細(xì)胞胞質(zhì)的灰度，見表2。

表2 紫杉醇作用下EJ細(xì)胞及Bcl-2基因表達(dá)的改變

注：與對照組比較 *為P<0.05，**為P<0.01

從表2中可以看出紫杉醇作用后，EJ細(xì)胞的面積縮小、圓形度增加、細(xì)胞變圓。紫杉醇作用后胞質(zhì)中bcl-2基因表達(dá)也降低，說明紫杉醇可抑制bcl-2基因表達(dá)。

3 討論

流式細(xì)胞儀檢測DNA圖上出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞二倍體峰為細(xì)胞凋亡峰，峰下的面積即為細(xì)胞凋亡率。圖1A為對照組的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，可知未加紫杉醇的EJ細(xì)胞也有少量發(fā)生凋亡。而紫杉醇濃度為100 nmol/L和1 000 nmol/L組凋亡率明顯增高，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明與對照組相比具有極顯著性差異。

本研究，流式細(xì)胞儀結(jié)合透射電鏡、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果[7]，能夠清楚看到紫杉醇有明顯誘導(dǎo)EJ細(xì)胞凋亡的作用。這與Frank等[8]的研究結(jié)果相一致。他們運(yùn)用Annexin及PI復(fù)染法檢測凋亡，來區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和死亡，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在較低濃度時(shí)便能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果可見，紫杉醇10 nmol/L以上組與對照組比較有非常顯著性差異，且隨紫杉醇濃度的增大細(xì)胞凋亡率也明顯增高。在10 nmol/L以上組，同一濃度下不同的作用時(shí)間細(xì)胞凋亡率也存在顯著性差異，作用時(shí)間長細(xì)胞凋亡率就高?？梢娮仙即颊T導(dǎo)EJ細(xì)胞凋亡具有明顯的時(shí)間-劑量依賴性。趙世義等[9]在紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中也得出了同樣結(jié)論。我們同時(shí)觀察到藥物濃度加大后(>1 000 nmol/L)壞死細(xì)胞逐漸增多。因此，我們認(rèn)為從凋亡角度看誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡應(yīng)選擇合適的藥物濃度和作用時(shí)間，這樣既可以啟動膀胱癌細(xì)胞的“自殺”程序，又可使正常細(xì)胞避免因藥物過大劑量和超長作用時(shí)間帶來的損害，任意提高藥物濃度及延長作用時(shí)間對誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡是無益的。

bcl-2原位雜交檢測結(jié)果顯示紫杉醇作用后，bcl-2在胞質(zhì)中的表達(dá)明顯降低。細(xì)胞圖像分析儀統(tǒng)計(jì)結(jié)果也表明bcl-2的表達(dá)隨紫杉醇濃度的增大而降低，紫杉醇可抑制bcl-2基因的表達(dá)。bcl-2基因(即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因)是1種原癌基因[10]。研究表明，bcl-2能夠抑制細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)細(xì)胞的生長，但是這種抑制機(jī)制目前仍不清楚[11]。研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡往往伴隨著bcl-2的磷酸化[12]。Haldar等[13]將白血病細(xì)胞用磷酸酶抑制劑處理后使bcl-2磷酸化，從而使細(xì)胞死亡，發(fā)現(xiàn)紫杉醇能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的bcl-2磷酸化及細(xì)胞凋亡，不能誘導(dǎo)bcl-2缺陷株的凋亡。bcl-2能與bax形成異緣二聚體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但bax的含量并沒有因紫杉醇的處理而發(fā)生變化，推測穩(wěn)定微管和bcl-2磷酸化可能是紫杉醇和同一靶位點(diǎn)相作用的結(jié)果，也許是通過刺激絲氨酸蛋白激酶途徑[14]。Haldar等認(rèn)為絲氨酸-70是紫杉醇誘導(dǎo)bcl-2磷酸化的一個重要作用位點(diǎn)，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)被丙氨酸取代后，bcl-2的磷酸化被顯著抑制[15]。最近又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Bcl-2上的一段60個氨基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是bcl-2對抗紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要區(qū)域，因?yàn)閎cl-2的磷酸化位點(diǎn)存在于該環(huán)中[16]。我們研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2在膀胱癌EJ細(xì)胞中具有明顯的表達(dá)，紫杉醇可抑制bcl-2的表達(dá)，其誘導(dǎo)bcl-2的磷酸化可能為EJ細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。

紫杉醇被譽(yù)為近15年來發(fā)現(xiàn)的最主要的抗癌藥物，預(yù)測在今后10～15年內(nèi)是抗癌的主要藥品之一[17]。我們的試驗(yàn)表明紫杉醇通過抑制bcl-2基因的表達(dá)，具有明顯誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡的作用。紫杉醇用于膀胱癌的治療臨床上還處于試驗(yàn)階段，如何選擇最佳的用藥劑量，減少紫杉醇化療的不良反應(yīng)以及紫杉醇誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，相信紫杉醇將會成為治療膀胱癌非常有價(jià)值的1種藥物。

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