DR-nm23基因及其蛋白在大腸癌組織中的表達研究

曲利娟 楊 直 曾 玲 熊喜生

DR-nm23基因又稱nm23-H3或NME3(non-metastatic cell 3)，是迄今nm23腫瘤轉移抑制基因家族8個成員(nm23-H1～nm23-H8)之一，系1995年由Venturelli等[1]應用cDNA文庫差異顯示篩選技術，從慢性粒細胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)急性發(fā)作期的原代細胞中克隆出。已知DR-nm23與細胞的增殖、分化、凋亡、黏附、侵襲等多種生物學行為有關，但該基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系的報道甚少，尤其是與大腸癌組織的相關性研究未見報道。正常-腺瘤-癌順序是人類大腸癌的發(fā)生、發(fā)展模式，本研究采用核酸原位雜交和免疫組化方法，檢測正常腸黏膜組織、腺瘤及大腸癌組織中DR-nm23的表達水平，從mRNA和蛋白2個水平上探討DR-nm23與大腸癌發(fā)生發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 病例材料

選取南京軍區(qū)福州總醫(yī)院2006年～2008年收治的、經病理檢查證實的大腸癌根治術標本98例，其中大腸癌不伴淋巴結轉移組59例，大腸癌伴淋巴結轉移組39例；39例轉移組中同時具有原發(fā)癌和淋巴結轉移癌29例。選取57例大腸管狀絨毛狀腺瘤為腺瘤組，其中腺瘤伴高級別上皮內腫瘤35例，腺瘤伴低級別上皮內腫瘤22例。另選取42例大腸癌無轉移組匹配鄰近正常黏膜組織為正常組。98例大腸癌組中，男性69例，女性29例，年齡27～79歲，中位年齡57.84歲。腫瘤發(fā)生部位：結腸46例，直腸52例。組織學類型：乳頭狀腺癌25例，管狀腺癌30例，黏液腺癌14例，低分化腺癌17例，印戒細胞癌12例。病理分級(參照2000年WHO分級標準)：Ⅰ級25例，Ⅱ級44例，Ⅲ級29例。所有標本經10％中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 核酸原位雜交

DR-nm23 mRNA寡核苷酸探針序列為5’-ATCCCGCTCCCGCACCGCCATC-3’，由上海博亞公司合成并進行5’端和3’端地高辛標記。敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅰ購自武漢博士德公司。按試劑盒說明書進行核酸雜交：切片脫蠟入水，3％ H2O2甲醇阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min；PBS 5 min×3，蒸餾水5 min×1；3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段，37℃消化20 min，PBS 5 min×3，雙蒸餾水5 min×1；滴加20 μl加預雜交液，37℃、4 h；吸去多余預雜交液，不洗；滴加20 μl雜交液，37℃、雜交12～16 h；雜交后洗滌；滴加封閉液，37℃、30 min；甩去多余液體，不洗；滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃、60 min；PBS 5 min×4；滴加SABC，37℃、20 min；PBS 5 min×3；滴加生物素化過氧化物酶，37℃、20 min；PBS 5 min×4；DAB顯色；蘇木精復染，鹽酸分化，水洗反藍；封固，光鏡下觀察。用不加探針的雜交液作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學

濃縮型羊抗人DR-nm23(編號SC-50945)多克隆抗體及即用型SABC免疫組化試劑盒，分別購自美國Santa Cruz 生物技術公司和武漢博士德生物工程有限公司。采用SP法免疫組織化學法染色：切片脫蠟入水，組織抗原高壓修復1 min 40 s，PBS 5 min×2；3％ H2O2阻斷過氧化氫酶活性10 min，PBS 5 min×2；正常兔血清室溫孵育15 min；羊抗人DR-nm23抗體(工作濃度1∶300)，4℃過夜12 h，PBS 3 min×3；生物素標記二抗室溫孵育15 min，PBS 3 min×3；辣根酶標記鏈霉卵白素室溫孵育15 min，PBS 3 min×3；DAB顯色，顯微鏡下觀察，水洗終止；蘇木精復染，鹽酸分化，水洗反藍；封固，光鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷

DR-nm23 mRNA雜交信號和DR-nm23蛋白陽性表達顆粒主要定位于細胞質。每張切片根據陽性率和雜交信號(或)著色強度分別進行評分：無著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，深棕色為3分；5％以下為0分，6％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，76％以上為4分。根據陽性率和雜交信號(或)著色強度兩項評分的乘積進行評價，結果分為3級：0～4分為陰性(-)，5～8分為弱陽性表達(+)，9～12分為強陽性表達(++)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件包，進行多個獨立樣本非參數Kruskal-Wallis Test檢驗和兩獨立樣本非參數Mann-Whitney Test檢驗。

2 結果

2.1 正常組、腺瘤組和大腸癌組中DR-nm23表達情況

正常組中DR-nm23 mRNA表達率為76.2％(32/42)，而腺瘤組(21/57，36.8％)、大腸癌組中其表達率(41/98，41.8％)均下降，3組表達差異顯著(χ2=21.866，P<0.01)；兩兩比較，正常組與腺瘤組(Z=-3.538，P<0.01)、正常組與大腸癌組(Z=-4.618，P<0.01)比較差異均顯著，腺瘤組與大腸癌組比較差異不顯著(Z= -0.093，P>0.05)。正常組DR-nm23蛋白表達率為71.4％(30/42)，腺瘤組(22/57，38.6％)、大腸癌組其表達率(25/98，35.7％)均下降，3組表達差異顯著(χ2= 25.852，P<0.01)；兩兩比較，正常組與腺瘤組(Z=-4.385，P<0.01)、正常組與大腸癌組(Z=-4.606，P<0.01)比較差異均顯著，腺瘤組與大腸癌組比較差異不顯著(Z=-0.024，P>0.05)，見表1。雜交信號和陽性顆粒均定位于細胞質。

表1 正常組、腺瘤組及大腸癌組中DR-nm23的表達情況(例，％)

與正常組比較，※為P<0.01；與腺瘤組比較，#為P>0.05

2.2 腺瘤組中低、高級別上皮內腫瘤DR-nm23的表達

低級別組DR-nm23 mRNA表達率為45.5％(10/22)，高級別組其表達率(31.4％，11/35)下降，2組比較差異不顯著(Z=-0.995，P>0.05)。DR-nm23蛋白低級別組表達率為59.1％(13/22)，高級別組(25.7％，9/35)其表達率下降，2組比較差異有顯著性(Z=-2.646，P<0.01)，見表2。

表2 腺瘤組低級別與高級別上皮內腫瘤中DR-nm23的表達情況(例，％)

2.3 DR-nm23表達與大腸癌臨床病理特征的關系

DR-nm23 mRNA表達與腫瘤病理分級密切相關(χ2=9.473，P<0.01)，分化越好，其表達率越高；其表達與大腸癌淋巴結轉移呈負相關性(Z=-3.555，P<0.05)，但與大腸癌組織學類型無相關性(χ2=9.142，P>0.05)。DR-nm23蛋白表達不僅與大腸癌淋巴結轉移呈負相關性(Z=-2.156，P<0.05)，而且與大腸癌組織學類型(χ2=13.731)和病理分級(χ2=12.198)相關(P<0.01)，見表3。

表3 DR-nm23表達與大腸癌臨床病理特征的關系(例，％)

2.4 大腸癌轉移組原發(fā)癌及其淋巴結轉移癌中DR-nm23的表達

原發(fā)癌和淋巴結轉移癌中DR-nm23 mRNA(Z=-1.188)及其蛋白(Z=-0.585)的表達差異均不顯著(P>0.05)，見表4。

表4 大腸癌轉移組原發(fā)癌和淋巴結轉移癌中DR-nm23的表達情況(例，％)

3 討論

轉移是大腸癌的重要生物學行為，是患者死亡主要原因之一。大量研究表明，腫瘤轉移過程涉及一系列復雜的分子事件，是多步驟、多因素、多基因共同參與的復雜病理過程。其中腫瘤轉移抑制基因nm23-H1與大腸癌轉移的相關性已得到公認。DR-nm23又稱nm23- H3是nm23腫瘤轉移抑制基因家族成員之一，基因定位于染色體16q13，cDNA全長849 bp，由6個外顯子和5個內含子組成，結構與nm23-H1和nm23-H2具有65％～70％高度同源性，但啟動子結構與該家族其他成員不同，幾乎不含經典的TATA框或CAAT框，而富含G+C[1]。位于上游遠端核苷酸+136～+143及轉錄起始點下游核苷酸-1028～-523處有SP1、Ap-2、Myb、ets、GATA和Hox-1等多個轉錄起始因子相關元件結合位點，參與調控基因的轉錄效率及活性，激活DR-nm23基因的表達[1，2]。DR-nm23基因所編碼的蛋白質產物是二磷酸核苷激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK)，NDPK的主要生理功能包括[3～5]：①具有組氨酸蛋白激酶活性，即通過磷酸組氨酸中間產物將與蛋白質結合的二磷酸核苷可逆磷酸化為三磷酸核苷，調節(jié)細胞內能量池大小，活化蛋白質，從而參與蛋白質各種功能的活動。②參與絲氨酸磷酸化及轉錄激活等。③具有ATP活性，參與CTP、UTP及GTP的生物合成。

研究表明，NDPK活性是nm23家族的共同特性，與細胞的分化和增殖活動密切相關[6～8]，但分子機制并不十分清楚。nm23家族成員在不同組織的表達和生物學功能不盡相同。nm23-H1與多種腫瘤轉移潛能密切相關[7]，nm23-H2調控c-myc原癌基因轉錄，參與細胞的生長、分化[8]；nm23-H4調節(jié)線粒體功能，與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉移有關[9]；睪丸特異性表達基因nm23-H5和nm23-H6～H8均被證實具有NDPK活性或NDPK樣區(qū)域，推測可能參與腫瘤的形成和進展機制[10]。DR-nm23在CML、星形膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、部分實體瘤如乳腺癌、胰腺癌、大腸癌、前列腺癌等均有表達。Venturelli等[11]研究發(fā)現DR-nm23在CML慢性期高表達，通過抑制粒細胞集落刺激因子誘導粒細胞分化，同時促進粒細胞凋亡，參與CML的發(fā)生、并使病情處于相對穩(wěn)定狀態(tài)；而在CML進展期DR-nm23表達下調或缺失，粒細胞分化嚴重抑制甚至停滯，使髓前體細胞過度增殖，病情急轉直下向急性發(fā)作期轉化。提示DR-nm23在造血細胞分化早期發(fā)揮重要作用，DR-nm23基因的突變、缺失和CML不同階段的差異表達，可能與CML的發(fā)生、發(fā)展和惡化密切相關。Huang等[12]研究顯示DR-nm23在正常腦組織中不表達，星形細胞瘤表達上調，表達與星形細胞瘤的發(fā)生有關。Amendola等[13，14]研究表明神經母細胞瘤分化越好DR-nm23表達水平越高； DR-nm23通過降低SK-N-SH神經母細胞瘤細胞株的細胞外基質的黏附性，促進Ⅳ型膠原增生，增加波形蛋白表達，從而抑制瘤細胞生長。這一特性在鼠NLE-15神經母細胞瘤細胞株的表現也得到驗證，研究顯示DR-nm23高表達能促進瘤細胞軸突快速生長，使β-整聯蛋白顯著增多，Ⅰ型膠原蛋白黏附性增加，抑制瘤細胞生長。此外，DR-nm23基因突變可減弱細胞分化能力，促進腫瘤轉移[15]。

本組實驗結果顯示：在mRNA和蛋白兩個水平，大腸癌組DR-nm23表達均較正常組、腺瘤組低，表達差異極顯著；兩兩比較，正常組與腺瘤組、正常組與大腸癌組的表達差異均顯著，但腺瘤組與大腸癌組間表達差異不顯著；腺瘤組中高級別上皮內腫瘤表達較低級別上皮內腫瘤下調。提示DR-nm23基因及其蛋白產物的表達水平下調與大腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關，且可能主要參與上皮內瘤變等癌前病變的過程。結果還顯示：DR-nm23基因表達與腫瘤病理分級相關，但與組織學分型無關；DR-nm23蛋白表達與腫瘤病理分級和組織學分型均有相關性，提示DR-nm23參與了大腸癌細胞的分化，癌細胞分化越好，DR-nm23表達率越高。

本組中淋巴結轉移組DR-nm23基因及蛋白表達較無淋巴結轉移組高，表達與淋巴結轉移呈負相關性，結果與孫青等[16]一致，提示DR-nm23可作為反映大腸癌生物學行為和預后的潛在重要指征之一。本組實驗結果還顯示：轉移組中，原發(fā)癌與其匹配淋巴結轉移癌DR-nm23在mRNA和蛋白水平表達差異不顯著，從另一方面也提示了大腸癌從原發(fā)灶向轉移灶轉移的過程，不僅是多基因、多因素、多機制共同參與的復雜病理過程，而且表達水平在轉移過程中也可能發(fā)生相應變化。

[1]Venturelli D，Martinez R，Melotti P，et al.Overexpression of DR-nm23，a protein encoded by a member of the nm23 gene family，inhibits granulocyte differentiation and induces apoptosis in 32Dc13 myeloid cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1995,92(16): 7435.

[2]曲利娟,丁彥青.DR-nm23基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系的研究進展〔J〕.國外醫(yī)學腫瘤學分冊，2005,32(5):336.

[3]Lacombe ML，Tokarska-Schlattner M，Epand RF，et al.Interaction of NDPK-D with cardiolipin-containing membranes: Structural basis and implications for mitochondrial physiology〔J〕.Biochimie，2009,91(6):779.

[4]Miyamoto M，Iwashita S，Yamaguchi S，et al.Role of nm23 in the regulation of cell shape and migration via Rho family GTPase signals〔J〕.Mol Cell Biochem，2009,329(1～2):175.

[5]Postel EH，Zou X，Notterman DA，et al.Double knockout Nme1/Nme2 mouse model suggests a critical role for NDP kinases in erythroid development〔J〕.Mol Cell Biochem，2009，329(1～2):45.

[6]Postel EH.Multiple biochemical activities of NM23/NDP kinase in gene regulation〔J〕.J Bioenerg Biomembr，2003，35(1): 31.

[7]Kim HD，Youn B，Kim TS，et al.Regulators affecting the metastasis suppressor activity of Nm23-H1〔J〕.Mol Cell Biochem，2009,329(1-2):167.

[8]Thakur RK，Kumar P，Halder K，et al.Metastases suppressor NM23-H2 interaction with G-quadruplex DNA within cM- YC promoter nuclease hypersensitive element induces c-MYC expression〔J〕.Nucleic Acids Res，2009,37(1):172.

[9]Tokarska-Schlattner M，Boissan M，Munier A，et al.The nucleoside diphosphate kinase D(NM23-H4)binds the inner mitochondrial membrane with high affinity to cardiolipin and couples nucleotide transfer with respiration〔J〕.J Biol Chem，2008,283(38):26198.

[10]Munier A，Serres C，Kann ML，et al.Nm23/NDP kinases in human male germ cells: role in spermiogenesis and sperm motility?〔J〕.Exp Cell Res，2003，289(2): 295.

[11]Venturelli D，Cesi V，Ransac S，et al.The nucleoside diphosphate kinase activity of DR-nm23 is not required for inhibition of differentiation and induction of apoptosis in 32Dcl3 myeloid precursor cells〔J〕.Exp Cell Res，2000，257(2): 265.

[12]Huatao Huang，Colella S，Kurrer M，et al.Gene expression profiling of low-grade diffuse astrocytomas by cDNA arrays〔J〕.Cancer Res，2000，60(24): 6868.

[13]Amendola R，Martinez R，Negroni A，et al.DR-nm23 gene expression in neuroblastoma cells: relationship to integrin expression，adhesion characteristics，and differentiation〔J〕.J Natl Cancer Inst，1997，89(17):1300.

[14]Amendola R，Martinez R，Negroni A，et al.DR- nm23 expression affects neuroblastoma cell differentiation，integrin expression，and adhesion characteristics〔J〕.Med Pediatr Oncol,2001,36(1): 93.

[15]Negroni A，Venturelli D，Tanno B，et al.Neuroblastoma specific effects of DR-nm23 and its mutant forms on differentiation and apoptosis〔J〕.Cell Death Differ，2000，7(9): 843.

[16]孫 青,丁彥青,高雪芹.腫瘤轉移相關cDNA基因芯片的制備與應用〔J〕.第一軍醫(yī)大學學報，2002,22(12):1070.