陳飛，關艷麗，吳紅艷，桓明輝，郭玲玲，于廣峰，修翠娟

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000)

鏈霉菌11371是遼寧省微生物科學研究院在廣西梧州地區(qū)土壤中分離得到的1株放線菌，其產生的Tetramycin對蘋果腐爛病、蘋果斑點落葉病、水稻稻瘟病等有良好的防治效果。為提高Tetramycin的產量，需進行原生質體和分子生物學等技術研究，原生質體的制備與再生是研究的前提和基礎。但是不同微生物的細胞壁組成各不相同，所以制備其原生質體的最佳條件也存在著很大差異。本實驗通過研究摸索制備原生質體的菌絲菌齡、酶濃度、酶解溫度等條件，獲得制備原生質體的最佳條件，初步確定了鏈霉菌11371制備與再生的最佳條件，為鏈霉菌11371以原生質體為材料的各種研究提供操作平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株不吸水鏈霉菌梧州新亞種(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp，以下簡稱鏈霉菌11371)。

1.1.2 培養(yǎng)基高氏一號液體培養(yǎng)基、高氏一號固體培養(yǎng)基、高氏一號再生培養(yǎng)基、菌絲生長液體培養(yǎng)基、菌絲生長固液體培養(yǎng)基等［1］。R2YE培養(yǎng)基：KH2PO40.25 g/L，蔗糖103 g/L，MgCl2·6H2O 10.12 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨0.1 g/L，酵母膏5.0 g/L，酪蛋白氨基酸0.1 g/L，微量元素溶液2.0mL，TES10mL，瓊脂粉18g/L。滅菌后按順序加入單獨滅菌的以下溶液：0.5%KH2PO410 mL/L，2.5 mol/L CaCl2·2H2O 8.0 mL/L，1.0 mol/L NaOH 7.0 mL/L。

1.1.3 試劑P-Buffer、溶菌酶、Tris、EDTA、微量元素溶液、蔗糖等。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌11371菌絲體培養(yǎng)取新鮮的斜面孢子接種于30 mL/250 mL三角瓶(帶有玻璃珠)的菌絲生長培養(yǎng)液中，28℃恒溫搖床培養(yǎng)。

1.2.2 原生質體的制備將菌液倒入離心管中，5 000 r/min離心10 min，收集菌絲體。加入5 mL 10.3%蔗糖洗滌2次，棄上清液。加入5 mL溶菌酶溶液，用吸管混合均勻。置于一定溫度的水浴中保溫，每隔15 min用吸管吹吸幾次，使形成的原生質體從菌絲上脫落下來，取樣鏡檢。將酶解后的菌液用4層擦鏡紙過濾于一新無菌離心管中，以濾去未被酶解的菌絲片段，3 000 r/min離心10 min，溫和沉淀原生質體。小心棄去上清液，手指輕輕敲打管壁，使原生質體分散在殘留的PBuffer中成奶狀懸浮液。加入5 mL P-Buffer洗滌沉淀2次，將原生質體沉淀懸浮于1 mL P-Buffer中。立即使用或冷凍保存。

1.2.3 原生質體制備條件的摸索①溶菌酶濃度對原生質體形成的影響［2-3］：將溶菌酶配制成2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的不同濃度，用無菌的微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過濾除菌，置于37℃恒溫水浴中酶解，并分別在顯微鏡下計數(shù)，記錄不同條件下原生質體形成的數(shù)量。確定原生質體形成與溶菌酶濃度的關系;②酶解溫度對原生質體形成的影響：將以最適溶菌酶濃度配制成的酶解液與11371的菌絲體混合，分別于31、34、37、40、43℃恒溫水浴酶解，并分別在顯微鏡下計數(shù)，記錄不同條件下原生質體形成的數(shù)量。確定原生質體形成與酶解溫度的關系;③酶解時間對原生質體形成的影響：將酶解液與11371的菌絲體混合，置于37℃恒溫水浴中分別作用30、60、90、120、150 min。并分別在顯微鏡下計數(shù)，記錄不同條件下原生質體形成的數(shù)量。確定原生質體形成與酶解時間的關系;④菌絲培養(yǎng)時間對原生質體形成的影響［4］：在11371菌絲的培養(yǎng)過程中，分別取培養(yǎng)36、39、42、45、48 h的11371菌絲體，用上述方法酶解，并分別在顯微鏡下計數(shù)，記錄不同條件下原生質體形成的數(shù)量。確定原生質體形成與菌絲培養(yǎng)時間的關系;⑤甘氨酸濃度對原生質體形成的影響［5］：按照上述11371菌株菌絲培養(yǎng)的方法，分別在菌絲生長培養(yǎng)液中加入0%、0.5%、0.7%、1.0%、1.2%、1.5%、2.0%、2.5%的甘氨酸，在28℃恒溫搖床培養(yǎng)42 h后制備原生質體，并分別在顯微鏡下計數(shù)，記錄不同條件下原生質體形成的數(shù)量。確定原生質體形成與甘氨酸濃度的關系。

1.2.4 原生質體的再生［6-7］取原生質體懸液在P-Buffer中稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5;同時在無菌水中稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。取0.1 mL經P-Buffer和無菌水稀釋的原生質體懸液涂布在干燥的最佳再生R2YE平板上，每個稀釋樣品涂布3個平板。28℃倒置培養(yǎng)5～7 d，統(tǒng)計原生質體再生的菌落數(shù)。

A：P-Buffer稀釋后的再生菌落數(shù)

B：無菌水稀釋后的再生菌落數(shù)

C：鏡檢計數(shù)的原生質體數(shù)×稀釋倍數(shù)×0.1 1.2.5原生質體再生條件的摸索［7］再生培養(yǎng)基對原生質體再生的影響：取0.1 mL原生質體稀釋液分別涂布在高氏一號、高氏一號再生、R2YE、菌絲生長培養(yǎng)基等再生培養(yǎng)基上，于28℃下恒溫培養(yǎng)。觀察鏈霉菌11371原生質體的再生情況。

2 結果與分析

2.1 溶菌酶濃度對原生質體形成的影響

在一定范圍內，隨著酶量的增加，原生質體化加速。但酶濃度過高對原生質體有毒害，隨著酶量增加，雜酶濃度也隨之增加，影響原生質體的活性。而且酶濃度過高易使菌體凝聚，難于原生質體化，并且細胞脫壁太徹底，也會使原生質體再生率降低。而過低的酶量又會影響原生質體生成量。試驗結果表明，隨著酶濃度的加大原生質體形成的數(shù)量也不斷增加，但當酶濃度達到3 mg/mL時，即使增加酶濃度，原生質體形成的數(shù)量也沒有明顯的增加。同時又由于作用時間太長，不利于原生質體再生，因此，選溶菌酶濃度3 mg/mL作為鏈霉菌11371原生質體制備和再生的最佳濃度。結果見圖1。

圖1 溶菌酶濃度對鏈霉菌11371原生質體制備率的影響Fig.1 The effect of lysozyme concentration on the rate of preparation of protoplasts

2.2 酶解溫度對原生質體形成的影響

圖2 酶解溫度對鏈霉菌11371原生質體制備率的影響Fig.2 The effect of enzymolysis temperature on the rate of preparation of protoplasts

溫度對酶解作用有雙重影響，一方面隨著溫度升高，酶解反應速度加快，但溫度過高酶易鈍化，還可能會影響原生質體本身的DNA或酶系統(tǒng)的活性;另一方面，溫度過低，酶解時間延長，從而增加了對形成的原生質體的毒害作用，兩者都會影響原生質體的再生率。從圖2中可以看出，鏈霉菌11371在31～43℃溫度范圍內，形成原生質體的數(shù)量明顯不同。考慮到溫度過高對原生質體再生不利，因此選用37℃為鏈霉菌11371原生質體制備的最佳酶解溫度。

2.3 酶解時間對原生質體形成的影響

酶解時間對原生質體的制備同樣具有雙重影響，一方面酶解時間的延長可能會增加原生質體的形成數(shù)量;但是，另一方面酶解時間的延長會對已形成的原生質體造成毒害作用，原生質體在繼續(xù)酶解的過程中有可能會喪失其基本的恢復功能，影響再生率。結果如圖3所示，隨著酶解時間的增加，原生質體形成的數(shù)量也不斷增加，但當酶解時間達到90 min和120 min時，原生質體的形成數(shù)量達到最大值，隨后酶解時間的繼續(xù)延長，原生質體的形成數(shù)量反而有下降的趨勢。因此，考慮到時間過長對原生質體的再生有影響，選用90 min為原生質體制備的最佳酶解時間。

圖3 酶解時間對鏈霉菌11371原生質體制備率的影響Fig.3 The effect of enzymolysis time on the rate of preparation of protoplasts

2.4 菌絲培養(yǎng)時間對原生質體形成的影響

處于不同生長時期的菌絲體，經酶解后一般都可形成原生質體，但活性差異較大。處于穩(wěn)定期和衰老期的菌絲體，由于菌絲體老化，生理活性降低，以此時期制備的原生質體大小差異明顯，再生能力較差。而對數(shù)生長期(包括對數(shù)前、中期)的菌絲體各部分生理差異小，菌絲活力高，利于原生質體形成，制備的原生質體內含物及細胞器缺損少，修復能力強，再生效果好。因此，要選用處于對數(shù)生長期的菌絲體制備原生質體。但處于不同對數(shù)生長時期的菌絲體對原生質體的制備和再生也存在一定程度的影響，為了得到較優(yōu)條件，本試驗考察了對數(shù)生長期內不同培養(yǎng)時間對原生質體制備的影響。結果如圖4所示，不同培養(yǎng)時間的鏈霉菌11371形成原生質體的數(shù)量不同，即隨著菌絲培養(yǎng)時間的延長，原生質體的形成數(shù)量明顯增多，培養(yǎng)時間為39～42 h時原生質體的形成數(shù)量基本呈最大值，隨后便開始下降。因此選用42 h為原生質體制備的菌絲最佳培養(yǎng)時間。

圖4 菌絲培養(yǎng)時間對鏈霉菌11371原生質體制備率的影響Fig.4 The effect of culture time on the rate of preparation of protoplasts

2.5 甘氨酸濃度對原生質體形成的影響

在菌絲生長培養(yǎng)液中加入適量的甘氨酸可以增加菌絲體對溶菌酶的敏感性，因為甘氨酸能取代細胞壁肽聚糖中D-Ala殘基，干擾交聯(lián)，引起細胞壁結構的不完整，有利于去除細胞壁，促進形成大量的原生質體。但是，若甘氨酸過多，菌絲生長會受到強烈抑制，使菌絲量銳減，無法滿足用于原生質體制備所需要的菌絲量，而且會使細胞壁結構過于疏松，這雖然有利于原生質體的形成，卻容易造成酶解過程中菌絲脫壁太徹底，對脆弱的原生質體造成難以修復的損傷，不利于原生質體再生。試驗結果表明，在濃度低于0.7%時，甘氨酸對11371菌絲體的生長有促進作用，原生質體的形成量有所增加;濃度大于0.7%時，菌絲生長量下降，甘氨酸表現(xiàn)出對鏈霉菌11371菌絲生長的抑制作用，并隨著甘氨酸濃度的增加，抑制明顯加強，并且原生質體形成的數(shù)量也顯著下降。因此甘氨酸濃度0.7%更有利于原生質體形成。結果見圖5。

圖5 甘氨酸濃度對鏈霉菌11371原生質體制備率的影響Fig.5 The effect of glycine concentration on the rate of preparation of protoplasts

2.6 再生培養(yǎng)基對原生質體再生的影響

在高氏一號培養(yǎng)基上幾乎無再生菌落長出;而添加了10.3%蔗糖(滲透壓穩(wěn)定劑)的高氏一號再生培養(yǎng)基上有再生菌落長出，原生質體的再生率僅有0.2‰左右，但再生菌落形態(tài)很小，且少數(shù)產生少量孢子，多數(shù)不產孢子;在菌絲生長培養(yǎng)基上再生培養(yǎng)，原生質體的再生率可達0.7‰左右，菌落生長緩慢，正常培養(yǎng)7 d菌落仍然很小且產孢少;而R2YE再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)的原生質體再生率較以上3種培養(yǎng)基都高，有2.0‰～3.0‰，正常培養(yǎng)7 d菌落即與原始菌落大小一致，產孢子也較多。由此，選定R2YE培養(yǎng)基為鏈霉菌11371的最適再生培養(yǎng)基。

3 討論

原生質體的制備和再生是進行外源DNA轉化的基礎。因為不同菌種原生質體的制備和再生條件存在著差異，所以在進行轉化操作之前需要對鏈霉菌11371菌株的原生質體制備和再生條件進行試驗，得到大量的原生質體和較高的再生率以便進行下一步的轉化操作。試驗得到的最佳制備條件是取新鮮的鏈霉菌11371斜面孢子接種于30 mL/250 mL三角瓶(帶有玻璃珠)含0.7%甘氨酸的菌絲生長培養(yǎng)液中，28℃恒溫搖床培養(yǎng)42 h，溶菌酶濃度為3 mg/mL，在37℃溫度下酶解90 min。最佳再生培養(yǎng)基為R2YE培養(yǎng)基。

再生培養(yǎng)基是原生質體進行再生的最重要的因素，它對原生質體既有維系、保護作用，又有支持的功效和營養(yǎng)的功能，直接關系到再生率的高低。一般的培養(yǎng)基就是在其菌體生長的培養(yǎng)基中加入滲透壓穩(wěn)定劑和營養(yǎng)物質。由于脫去細胞壁的原生質體需要環(huán)境中具有一定的滲透壓力才能維持其固有的狀態(tài)(圓形)，否則便會因吸水膨脹而破裂或因失水而皺縮。為保證原生質體的生長，還必須在再生培養(yǎng)基中加入營養(yǎng)物質。添加的營養(yǎng)物質可分為2類，一類是適合于作為細胞壁合成的前體物質(如各種氨基酸、水解酪蛋白等易于用來合成放線菌細胞壁肽聚糖中的短肽鏈);另一類是通過代謝轉化成細胞壁前體物質或促進代謝，加速細胞壁合成的營養(yǎng)因子(如含有大量維生素的酵母膏、各種血清蛋白、各種糖及各種原生質體擴張劑等)。

此外由于原生質體再生的非同步化，早期繁殖起來的菌落會產生自我抑制物質，自我抑制物質又可通過平板上多余的水分擴散，從而抑制周圍原生質體的再生，而再生培養(yǎng)基的表面脫水可完全消除這種抑制作用，提高再生率。并且脫水后使平板表面干燥，無冷卻水在表面形成可導致原生質體破裂的低滲環(huán)境，因此再生平板在使用之前需進行脫水處理，可置于50℃烘箱中30 min或37℃溫箱過夜［8］。

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［8］ 賀筱蓉，黃小倩.鏈霉菌原生質體的再生［J］.生物學通報，1998，33(2)：40-44.