杜雷，趙高嶺，席宇，臧曉靜，朱大恒

鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號450001

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界上應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物，其發(fā)酵方法主要有液體深層發(fā)酵和固體淺盤發(fā)酵［1］。目前大多數(shù)廠家使用的是液體深層發(fā)酵，但液體發(fā)酵需要昂貴的設(shè)備，濃縮和干燥耗能大，成本高，從而影響了生物農(nóng)藥的推廣和應(yīng)用。固體發(fā)酵作為蘇云金芽孢桿菌工業(yè)發(fā)酵的方法之一，與液體發(fā)酵相比在生產(chǎn)中逐漸體現(xiàn)出其優(yōu)勢，如廢水、廢渣少，環(huán)境污染少，能源消耗量低，工藝設(shè)備和技術(shù)較簡單，投資低，并且產(chǎn)物濃度高，產(chǎn)品易保存，便于包裝和運(yùn)輸［2］。煙梗是煙草工業(yè)的副產(chǎn)物，我國每年約有數(shù)10萬t煙梗廢棄物被棄置浪費(fèi)［3］。目前主要集中于打葉復(fù)烤廠內(nèi)，不僅占用大量的倉庫還需專人管理，如何對其充分利用已成為企業(yè)的迫切需求。目前對煙梗的利用方法主要是制造梗絲和煙草薄片用于卷煙配方中，也有從煙梗中提取煙堿、茄尼醇、煙酸、果膠、植物蛋白等成分［4］的探索研究，但這些方法的利用量不大，每年仍有大量煙梗被廢棄，造成自然資源的浪費(fèi)。煙梗中含有豐富的有機(jī)碳、氮和無機(jī)鹽，是很好的發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)［5］。目前用于蘇云金芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵的原料主要是農(nóng)副產(chǎn)品，大量生產(chǎn)相對成本比較高。張怡等［6］將經(jīng)處理后的廢煙葉作為原料與麩皮混合作為載體，探索了固態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌的方法，但直接用煙梗為原料固態(tài)培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌的研究尚未見報(bào)道。為此，以煙梗為主要發(fā)酵原料，對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分配比和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在探討利用煙梗采用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)蘇云金芽孢桿菌的可行性，以降低蘇云金芽孢桿菌的生產(chǎn)成本，并為煙梗廢料的綜合利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：蘇云金芽孢桿菌HD-1，商業(yè)菌種，本實(shí)驗(yàn)室保存。煙梗由天昌國際煙草有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉20 g，瓊脂20 g，水1000 mL；液體種子培養(yǎng)基：不加瓊脂即可，在121℃滅菌20 min后備用。

篩選固體培養(yǎng)基：煙梗（粉碎過16目篩），玉米粉，豆餅粉（購于市場），蛋白胨（鄭州創(chuàng)生），酵母粉（英國Oxoid公司），KH2PO4，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4，MnSO4（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）。

1.3 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化設(shè)計(jì)

碳、氮源配比的優(yōu)化：以煙梗為主要碳源，以蛋白胨、酵母粉、豆餅粉和玉米粉為補(bǔ)充氮源［7］，每個(gè)因素選高低4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［8］，應(yīng)用L16（45）正交表對各組分進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，考察不同培養(yǎng)基組分對活芽孢數(shù)的影響。各因素水平見表1。

無機(jī)鹽優(yōu)化：確定好碳、氮源配比后，將KH2PO4，F(xiàn)eSO4，（NH4）2SO4和MgSO4·7H2O 4個(gè)因素作為培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分，每個(gè)因素選3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，應(yīng)用L9（34）正交表對無機(jī)鹽組分進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。各因素水平見表2。

表1 培養(yǎng)基的碳、氮源正交試驗(yàn)水平Tab.1 Level of carbon and nitrogen resourcein medium（g）

表2 培養(yǎng)基的無機(jī)鹽正交試驗(yàn)水平Tab.2 Level of inorganic saltin medium （g）

1.4 三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將各種配比的培養(yǎng)基配置好后裝入250 mL的三角瓶，加水后搖勻，滅菌接種后培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件先按初始含水率60%，接種量5%，初始pH7.0，放入30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時(shí)翻動搖勻培養(yǎng)基，并取樣涂片、染色觀察，至芽孢脫落率達(dá)到30%時(shí)終止培養(yǎng)，測其活芽孢數(shù)。

1.5 培養(yǎng)基條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)

確定最優(yōu)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分組合后，用單因素試驗(yàn)方法，分別對接種量，培養(yǎng)基的初始pH，初始含水率進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 分析方法

采用孔雀綠及沙黃染色法觀察芽孢的形成，平板菌計(jì)數(shù)法［9］對固體培養(yǎng)芽孢計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳、氮源的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)表l正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對HD-1菌株進(jìn)行固體發(fā)酵，結(jié)果表明（表3）：由極差R可以看出，各因素對產(chǎn)孢量的影響為：煙草廢料＞酵母粉＞玉米粉＞豆餅粉＞蛋白胨；煙梗固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為：煙梗15 g，酵母粉0.2 g，蛋白胨0.2 g，黃豆餅粉1 g，玉米粉0.5 g。煙梗為菌體生長提供碳源，又是菌體生長的載體，且其含有豐富的糖類，很適宜作為發(fā)酵材料。由表3可以看出，以蛋白胨為氮源對產(chǎn)芽孢數(shù)量影響不大，但以酵母粉、豆餅粉、玉米粉為補(bǔ)充氮源時(shí)影響較大，它們與煙?；旌希蟠蟾纳屏伺囵B(yǎng)基的發(fā)酵性能，提高了芽孢產(chǎn)率。

表3 L16（45）碳氮源優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Designandresulto for thogonal test for optimizingcarbonandnitrogenresource

2.2 無機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)

在菌體的生長中，許多礦質(zhì)元素都直接參與細(xì)胞的組成、能量的轉(zhuǎn)移、維持原生質(zhì)的膠質(zhì)體系和滲透性，對生長起著重要的作用。其中Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Ca2+的適當(dāng)濃度對營養(yǎng)細(xì)胞的生長、芽孢和伴孢晶體的形成有明顯刺激作用［8］。由表4可以看出，KH2PO4的影響最顯著，其次是MgSO4·7H2O，MnSO4和FeSO4的影響較小。最佳無機(jī)鹽配比為KH2PO40.03 g，F(xiàn)eSO40.02 g，MnSO40.03 g和MgSO4·7H2O 0.04 g。

2.3 接種量對芽孢形成的影響

接種量是與培養(yǎng)基利用率直接相關(guān)的參數(shù)。接種量大時(shí)盡管可以使芽孢生長快、周期短，但后期可能因缺乏營養(yǎng)而無法達(dá)到較高的芽孢數(shù)；而接種量太小時(shí)不僅對營養(yǎng)利用不充分，且發(fā)酵周期可能延長，染菌幾率提高［10］。在確定最佳培養(yǎng)基組成成分后，將其接種量設(shè)為4%，5%，6%，7%和8%5個(gè)因素水平進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，接種量在6%時(shí)產(chǎn)孢量最高，可達(dá)9.0×1010CFU/g。

表4 無機(jī)鹽優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and result of orthogonal test for optimizing inorganic salt

圖1 接種量對芽孢數(shù)的影響Fig.1 Effect of the inoculum size on spores formation

2.4 初始含水率對芽孢形成的影響

初始含水率對芽孢形成有較大的影響。水分適宜則菌體生長好，產(chǎn)品毒力效價(jià)高；水分過多則物料通氣性差，菌體得不到充足的氧氣，生長受到限制；水分偏少時(shí)，菌體吸收不到水分和溶解在水中的營養(yǎng)，生長也受到限制［11-12］。本試驗(yàn)將初始含水率設(shè)為55%，60%，65%，70%和75%5個(gè)因素水平進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)初始含水率為65%時(shí)，芽孢數(shù)量最高，可達(dá)到8.5×1010CFU/g。

2.5 初始pH對芽孢形成的影響

培養(yǎng)基的pH值不僅影響芽孢的萌發(fā)，還影響芽孢的形成。本試驗(yàn)將初始pH設(shè)為5.5，6.5，7.5，8.5和9.5 5個(gè)因素水平進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，初始pH為7.5時(shí)，芽孢數(shù)最多，可達(dá)到9.5×1010CFU/g。當(dāng)pH為5.5和9.5時(shí)，芽孢數(shù)明顯減少，這是因?yàn)樘K云金芽孢桿菌在芽孢形成的初始階段，菌體合成一種胞外蛋白酶參與伴孢晶體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化合成過程，而這種酶的合成與酶活性最適pH值為中性，pH值在6.5以下或9.1以上時(shí)酶活性急劇下降，喪失形成這種酶的變異菌株既不能形成芽孢，也不能形成晶體［13］。

圖2 初始含水率對芽孢數(shù)量的影響Fig.2 Effect of initial moisture content on spore formation

圖3 初始pH對芽孢數(shù)量的影響Fig.3 Effect of initial pH on spore formation

3 小結(jié)

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基組成，其中包括煙梗廢料88.13%，酵母粉1.17%，蛋白胨1.17%，豆餅粉5.88%，玉米粉2.93%，KH2PO40.18%，MgSO4·7H2O 0.24%，F(xiàn)eSO40.12%，MnSO40.18%。補(bǔ)充培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和無機(jī)鹽對蘇云金芽孢桿菌的生長和芽孢產(chǎn)量有較大促進(jìn)作用。

通過單因素試驗(yàn)確定了最佳培養(yǎng)條件為：接種量為6%，初始含水率65%，初始pH7.5，在此發(fā)酵條件下蘇云金芽孢桿菌HD-1的芽孢數(shù)可穩(wěn)定在9.5×1010CFU/g，達(dá)到了每克培養(yǎng)物含芽孢數(shù)100億個(gè)以上的國家標(biāo)準(zhǔn)［14］。

本試驗(yàn)證實(shí)了以煙梗作為培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物農(nóng)藥的可行性，與液體發(fā)酵法相比［15］，其產(chǎn)孢量大大提高，且在生產(chǎn)中更易于推廣應(yīng)用。

［1］校逸，胡瀟涵，陳建幫，等.Bt生物農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵研究進(jìn)展［J］.金屬世界，2009（2）：99-102.

［2］方蘋，韋萍，范偉平，等.蘇云金桿菌固體發(fā)酵工藝研究［J］.南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（6）：84-87.

［3］白聚川，董占能，張皓東.煙草廢棄物的綜合利用［J］.中國野生植物資源，2007，26（5）：41-43.

［4］艾心靈，王洪新，朱松.煙草中綠原酸、煙堿和茄尼醇的超聲波輔助提取［J］.煙草科技，2007（4）：45-48.

［5］王月俠，葛菩禮，賈濤，等.煙梗化學(xué)組成的分析［J］.煙草科技，1996（3）：16-17.

［6］張怡，楊天雪，秦旌，等.廢次煙草作為載體在固態(tài)發(fā)酵體系中的綜合利用［J］.煙草科技，2000（7）：5-7.

［7］盧新民，陳若霞，葉恭銀，等.蘇云金桿菌菌株YJ-2000生長和伴孢晶體形成的適宜培養(yǎng)條件［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（1）：6-10.

［8］李春喜，王志和，王文林.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)（第2版）［M］.北京：科學(xué)出版社，2000：149-156.

［9］陳聰.蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化［D］.福建農(nóng)林大學(xué)，2004.

［10］陶玉貴.生物農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵條件的研究［J］.安徽師范大學(xué)報(bào)，2001，24（1）：31-34.

［11］弓愛君，孫翠霞，邱麗娜，等.Bt生物農(nóng)藥［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：93-98.

［12］KaurS.Molecularapproachestowardsdevelopmentof novelBacillusThuringiensisbiopesticides［J］.WorldJ Microbiol&Biotech，2000（16）：781-793.

［13］翟興禮.蘇云金芽孢桿菌四個(gè)亞種對溫度和pH值的耐受性［J］.商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，6（25）：103-105.

［14］喻子牛.蘇云金桿菌［M］.北京：科學(xué)出版社，1990.

［15］李超，杜雷，席宇，等.煙梗廢料液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽孢桿菌的適宜條件篩選［J］.煙草科技，2011（3）：69-71.