李 慧,蒲 鑫,武 蕓,丁 莉*
(1.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.湖北省生物資源保護與利用重點實驗室(湖北民族學(xué)院),湖北 恩施 445000)
川續(xù)斷為雙子葉植物綱菊亞綱川續(xù)斷目川續(xù)斷科植物.因產(chǎn)地湖北五峰縣、鶴峰縣的品質(zhì)優(yōu)良,資源豐富,常被稱作“五鶴續(xù)斷”,是常用的中藥之一,具有補肝益腎,續(xù)接筋骨,抗骨質(zhì)疏松,止血安胎等功效.川續(xù)斷中含有揮發(fā)油、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)和多種重金屬離子等主要有效成分.關(guān)于川續(xù)斷植物的研究主要集中在道地歷史考證、有效成分及藥理作用等,分子生物學(xué)方面的研究甚少[1-2].另外,在對川續(xù)斷進行研究時,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的植株之間光合能力和同工酶方面存在差異[3-4],從分子水平探討其是否存在遺傳方面差異尚未見研究.
為了發(fā)掘新的川續(xù)斷種質(zhì)資源,培育川續(xù)斷新品種,本試驗以恩施州8個不同產(chǎn)地的川續(xù)斷單株為研究材料,采用RAPD技術(shù)進行了聚類分析,從而研究材料間的遺傳學(xué)差異,旨在為今后進一步開發(fā)利用川續(xù)斷提供參考[5].
供試材料來源見表1.
表1 供試材料來源
Taq DNA聚合酶購自Promega(上海);dNTPs(2.5 mmol/L each);Tris base為武漢天源生物技術(shù)有限公司分裝的Amresco;RAPD隨機引物購自上海生工生物工程有限公司,瓊脂糖產(chǎn)于spain的Biowest Agarose;DL3000 DNA Marker購自上海雷浩信息科技有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純生化試劑.
飛鴿牌GL-16G-A高速冷凍離心機,BIORAD凝膠成像系統(tǒng),BeckmanD/U530紫外分光光度計,新飛BCD-219冰箱V,Biohit proline移液槍,美國ABI2720型PCR擴增儀,DYY-10C型電泳儀(北京市六一儀器廠),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋.
以CTAB法提取上述材料,參照李合生等的方法[5].
取上述方法提取的基因組DNA 30 μL,稀釋100倍,在紫外分光光度計上測A230、A260、A280,根據(jù)DNA濃度(μg/mL)=50×OD260 nm×稀釋倍數(shù),確定DNA母液濃度,進而按50 ng/μL進行稀釋.
反應(yīng)采用20 μL的PCR體系,其中模板DNA濃度 為50 ng/μL,引物濃度為1.0 μmol/L,Mg2+濃度為2.5 mmol/L的,dNTP各0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,39℃的退火溫度在ABI2720型PCR擴增儀中進行反應(yīng).反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s, 39℃退火40 s, 72℃延伸2 min,43個循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存.得到的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,EB中染色30 min,凝膠成像系統(tǒng)照相保存.
對擴增后電泳帶的總數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)進行統(tǒng)計,按照Nei[6]的公式,根據(jù)材料間譜帶的數(shù)目,求出各自材料間的相似系數(shù):R=2Nxy/(Nx+Ny);其中R為材料x和y的相似系數(shù),Nxy代表材料x和y經(jīng)RAPD擴增后所共有的條帶數(shù)目,Nx和Ny分別代表x和y材料分別具有的總擴增條帶數(shù).并根據(jù)在某一位點形成譜帶記為1,某一位點未形成譜帶記為0,構(gòu)建8個產(chǎn)地續(xù)斷基于RAPD擴增的譜帶原始二態(tài)數(shù)據(jù)矩陣,利用NTSYS(2.01)軟件進行聚類分析.
采用CTAB法提取的DNA條帶較均一,無降解彌散的現(xiàn)象.說明CTAB法適合五鶴續(xù)斷基因組DNA的提取,這與其他研究結(jié)果一致[7].
通過對RAPD反應(yīng)體系各重要因素的優(yōu)化,從50條隨機引物中篩選出了擴增條帶豐富、多態(tài)性好的5條引物序列,并發(fā)現(xiàn)這些序列的G/C含量都在50%以上(見表2).圖1、2為引物P7、P9對8份材料的擴增結(jié)果.RAPD統(tǒng)計結(jié)果表明,5條引物總共擴增出53條電泳譜帶,得到的DNA片斷大小為300~2 500 bp.其中,引物P7擴增的帶中,所有材料在1 000 bp和1 600 bp處有共有帶,其余條帶均為多態(tài)性帶.綜合各引物的擴增帶,得到8份材料川續(xù)斷的分子識別表(見表3).引物P9擴增出的14條帶中,所有材料在DNA片段100、600、800、1600、1 800、2 000、2 300 bp處均有共同的條帶,在DNA片段400 bp處,只有建始縣龍坪、鶴峰縣太平鄉(xiāng)和鶴峰縣五里坪在這個位點上形成條帶(圖1、2),其他產(chǎn)地的續(xù)斷在這個位點上均未形成帶.
表2 篩選出的引物及其序列
圖1 P7引物的擴增效果 圖2 P9引物的擴增效果 Fig.1 Amplification products of primer P7 Fig.2 Amplification products of primer P9
產(chǎn)地總譜帶數(shù)可與其他產(chǎn)地區(qū)別的位點產(chǎn)地總譜帶數(shù)可與其他產(chǎn)地區(qū)別的位點建始縣龍坪鄉(xiāng)251900bp利川市元堡鄉(xiāng)25—恩施市魚塘壩上壩25—恩施市魚塘壩硒礦區(qū)23—巴東縣綠蔥坡24—恩施市雙河鄉(xiāng)19—鶴峰縣太平鄉(xiāng)231500bp鶴峰縣五里坪23—
由表4可見,8個產(chǎn)地基于RAPD擴增反應(yīng)得到的條帶之間相似系數(shù)差異較小,波動的幅度在0.81~0.96,說明材料間親緣關(guān)系較近,變異較小.
表4 續(xù)斷基因型相似系數(shù)對稱性矩陣
圖3 基于RAPD的續(xù)斷聚類分析圖Fig.3 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper by RAPD
由圖3可以看出,利用RAPD方法,根據(jù)相似系數(shù)的聚類結(jié)果,在聚類距離0.85左右,可將8份川續(xù)斷材料分為三大類.第Ⅰ大類包括川續(xù)斷1號(建始縣龍坪)、川續(xù)斷2號(利川市元堡)、川續(xù)斷3號(恩施市魚塘壩上壩)、川續(xù)斷4號(恩施市魚塘壩硒礦區(qū))、川續(xù)斷5號(巴東縣綠蔥坡);第Ⅱ包括川續(xù)斷7號(鶴峰縣太平鄉(xiāng))和川續(xù)斷8號(鶴峰縣五里坪);川續(xù)斷6號(恩施市雙河)獨立分為一類.
RAPD分子標記技術(shù)因為具有可供選擇標記數(shù)量多、無器官和發(fā)育時期的特異性等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于生物的遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究,特別適用于近緣屬級以下(包括近緣屬間)的研究[8].
從本研究的RAPD電泳圖譜可以看到,8個不同產(chǎn)地的川續(xù)斷材料的主要譜帶基本一致,說明它們的親緣關(guān)系很近,但次譜帶間又存在著較細微的差異,說明存在一定的遺傳多樣性.根據(jù)遺傳關(guān)系聚類分析,地理位置很近的恩施市魚塘壩上壩、恩施市魚塘壩硒礦區(qū)和恩施市雙河的川續(xù)斷沒有分成一類,可能是由于前兩者處于硒礦區(qū),而硒在植物生長中有很重要的作用[9-10].除此之外,本實驗的分類結(jié)果基本以地理分布為主,地理位置越接近的,親緣關(guān)系越近,之間的差異就較小,所以不同的生境是影響川續(xù)斷不同性狀的主要原因之一.另外,在對不同產(chǎn)地的續(xù)斷的過氧化物同工酶研究中,將8份材料分為了2大類,與本研究的分類結(jié)果基本一致,說明這種分析方法是可行的.
利用分子生物學(xué)方法研究恩施州內(nèi)的川續(xù)斷的種質(zhì)資源,從分子水平揭示其親緣關(guān)系的遠近,不僅可以為川續(xù)斷的系統(tǒng)選育和引種栽培提供理論依據(jù),還可以為進一步研究川續(xù)斷種質(zhì)資源的起源和進化問題提供參考.
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