程新華,覃大吉，向極釬*,龍 瀾

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新中心鄂西綜合試驗(yàn)站,湖北 恩施 445000; 2.恩施清江生物工程有限公司,湖北 恩施 445000)

目前，有很多提取制備厚樸酚及和厚樸酚混合物的文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]，但是將厚樸酚及和厚樸酚混合物分離純化成單體的報(bào)道不多，趙春穎等[8]采用樹脂分離、純化厚樸總酚，但是厚樸酚純度只能達(dá)到95%.中壓硅膠層析具有較高分離效率，是分離純化厚樸酚及和厚樸酚可行的方法.本文利用中壓硅膠層析對(duì)厚樸酚及和厚樸酚混合酚進(jìn)行初步分離，再利用85%甲醇重結(jié)晶，制備高純度的厚樸酚與和厚樸酚單體.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜分析儀(2695分離單元+2696二極管矩陣檢測(cè)器，美國(guó)waters公司)；BC-R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司)；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；WRS-2A微機(jī)熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；中壓層析系統(tǒng)(UV9091771218紫外檢測(cè)器+HEP-200A恒流泵+500 mm×50 mm不銹鋼層析柱+EasyChrom-1000色譜工作站，北京慧得易科技有限責(zé)任公司)；BT25S十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯股份有限公司)；DZKW恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠).

厚樸酚及和厚樸酚對(duì)照品(西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司)；厚樸酚及和厚樸酚混合物(自制，其中厚樸酚純度為48%，和厚樸酚純度為47%)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯(分析純，武漢市江北化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)；苯(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；60～90 ℃石油醚(分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；200～300目柱層析硅膠(青島美高集團(tuán)有限公司)；35 mm×75 mm薄層硅膠G板(青島海浪硅膠干燥劑廠)；硫酸(分析純，武漢市中天化工有限責(zé)任公司)；香草醛(分析純，湖北健源生物科技有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 確定最佳的硅膠層析流動(dòng)相 稱取10 mg厚樸酚及和厚樸酚混合物，用甲醇溶解并定容至10 mL，作為供試溶液；另取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品配制成1 mg/mL的甲醇溶液，作為對(duì)照品溶液；分別取上述的供試溶液和對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以展層劑展開，取出，晾干，然后噴以1%香草醛硫酸溶液，在100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰.供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn).通過(guò)厚樸酚及和厚樸酚分開程度和Rf值確定最佳的展層劑即柱層析的流動(dòng)相.

1.2.2 厚樸酚及和厚樸酚最佳吸收波長(zhǎng)的確定 分別配制0.1 mg/mL厚樸酚以及和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定最佳的吸收波長(zhǎng).

1.2.3 厚樸酚及和厚樸酚含量的測(cè)定 色譜柱：Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：乙腈-水(75∶35)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；柱溫：30℃.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用甲醇配制厚樸酚及和厚樸酚濃度均約為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液.進(jìn)樣量分別為0、4、8、10、12、16、20 μL，用HPLC進(jìn)行分析，以厚樸酚及和厚樸酚對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸.

152 程序性死亡配體 1 在索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞中的表達(dá)和功能 孫非凡，李 東，李 華，王 濤，劉 煜，張 濤

厚樸酚的回歸方程：

y=1 241 261.99x-104 234.57，R2=1.00；

和厚樸酚的回歸方程：

y=1 553 096.8x-26 011，R2=1.00.

其中:x表示厚樸酚或和厚樸酚的質(zhì)量，μg；y表示厚樸酚或和厚樸酚的色譜峰面積.樣品溶液經(jīng)0.45 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，定量進(jìn)樣10 μL.

1.2.4 柱層析硅膠預(yù)處理以及裝柱 把200～300目的柱層析硅膠于105 ℃活化2 h，然后加入柱層析流動(dòng)相中，混勻，并且按同樣方向不斷的攪拌以去除其中的氣泡.待沒有氣泡時(shí)，把硅膠緩緩加入含有少量流動(dòng)相的硅膠柱中.在濕法裝柱時(shí)，還需要輕輕敲打硅膠柱使硅膠填充均勻.待硅膠裝滿層析柱后，密封，然后用分離式液壓起頂機(jī)把硅膠壓實(shí)，壓縮比為85%，裝好的硅膠柱需用3～4 BV流動(dòng)相沖洗并且平衡.硅膠柱中的硅膠總量約為400 g，柱體積為900 mL.

2 結(jié)果與討論

2.1 確定最佳的展開劑

實(shí)驗(yàn)中考察了不同的展開劑，60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯體系、60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇體系、60℃～90℃石油醚-甲醇體系、苯-甲醇體系，每種體系配制了一系列的不同配比.通過(guò)厚樸酚及和厚樸酚的分離度和Rf值確定最佳的展開劑配比.不同展開劑的分離效果見表1.

從表1可以看出，60℃～90℃石油醚-甲醇體系對(duì)厚樸酚及和厚樸酚混合物的分離效果不好，Rf值小，是由于該體系的極性小的緣故；60℃～90℃石油醚-甲醇體系Rf值適中，但是厚樸酚及和厚樸酚的分離度小，斑點(diǎn)有重疊現(xiàn)象，分離效果也不理想；苯-甲醇體系、60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇體系均能取得較好的分離效果，厚樸酚及和厚樸酚的斑點(diǎn)清晰，沒有重疊現(xiàn)象，可以作為柱層析的流動(dòng)相.

2.2 厚樸酚及和厚樸酚最佳吸收波長(zhǎng)的確定

用甲醇溶解厚樸酚對(duì)照品，配制成0.5 mg/mL，用甲醇作空白對(duì)照，用紫外-可見分光光度計(jì)在190～400 nm進(jìn)行掃描，全波長(zhǎng)掃描圖見圖2.

表1 不同展開劑的分離效果

從圖1可以看出，在波長(zhǎng)290～294 nm處有較大的吸收值，250 nm處為溶劑的吸收峰，不能作為紫外檢測(cè)的波長(zhǎng)，所以確定290～294 nm為厚樸酚的最佳吸收波長(zhǎng)，結(jié)果與文獻(xiàn)一致[9].

2.3 中壓硅膠層析分離厚樸酚及和厚樸酚混合物

2.3.1 不同層析流動(dòng)相的分離效果比較 實(shí)驗(yàn)中考察了60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)、60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(30∶1)這幾種流動(dòng)相對(duì)厚樸酚及和厚樸酚的分離效果.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，先用層析流動(dòng)相平衡硅膠柱，待基線平穩(wěn)時(shí)進(jìn)行層析.濕法上樣，樣品用相應(yīng)的流動(dòng)相溶解，厚樸酚及和厚樸酚混合物的上樣量為3.0～3.2 g，層析時(shí)的流速為40 mL/min，層析壓力為3.2～4.5 kgf/cm2，用紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并用色譜工作站對(duì)圖譜進(jìn)行分析處理.層析開始時(shí)，按每5 min分段收集流出液，當(dāng)出現(xiàn)厚樸酚的色譜峰時(shí)，按每2 min分段收集流出液，直至色譜峰完全收集完畢.收集好的樣品先用TLC進(jìn)行分析，合并具有相同成分和純度的樣品，減壓回收溶劑，干燥，即得到厚樸酚、和厚樸酚樣品，最后用HPLC分析其純度，并且計(jì)算產(chǎn)品的收率.不同層析流動(dòng)相的分離效果見表2-4，分離色譜圖見圖2-4.

圖1 厚樸酚全波長(zhǎng)掃描圖 圖2 石油醚-乙酸乙酯-甲醇為流動(dòng)相時(shí)的層析色譜圖

從表2可以看出，正向硅膠層析時(shí)，厚樸酚較和厚樸酚先流出硅膠柱.厚樸酚流出時(shí)的純度(7#)不高由于其中還有雜質(zhì)一起流出色譜柱，繼續(xù)收集時(shí)，厚樸酚的純度逐漸升高(8#、9#)，純度達(dá)到96%以上.當(dāng)收集到10#樣品時(shí)，和厚樸酚夾雜在厚樸酚的樣品中，色譜圖中也沒有出現(xiàn)厚樸酚峰、和厚樸酚峰的分裂，只是一個(gè)單峰，厚樸酚、和厚樸酚色譜峰有嚴(yán)重的重疊現(xiàn)象，這樣就造成厚樸酚、和厚樸酚的純度都不高.隨后樣品中主要有和厚樸酚，純度達(dá)到99%以上.和厚樸酚通過(guò)中壓硅膠層析的純度就可以達(dá)到98%以上，收率31%；厚樸酚通過(guò)中壓硅膠層析的純度可以達(dá)到96%以上，收率35%，但是要達(dá)到更高的純度需要重結(jié)晶進(jìn)一步的純化.在厚樸酚、和厚樸酚混合樣品(10#、11#)中，可以利用層析繼續(xù)純化.從色譜圖2中可以看出，厚樸酚、和厚樸酚只有一個(gè)色譜峰，但是峰型較好，拖尾不嚴(yán)重.層析時(shí)所得樣品的顏色為白色和淺黃色.

圖3 石油醚-乙酸乙酯為流動(dòng)相時(shí)的層析色譜圖 圖4 苯-甲醇為流動(dòng)相時(shí)的層析色譜圖

流動(dòng)相名稱流出液樣品序號(hào)樣品中厚樸酚純度/%樣品中和厚樸酚純度/%樣品收率/%783．610．841．88896．500．7616．73997．661．4519．18石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0．5∶1)1080．8418．788．62115．8692．4214．6012—99．3919．4713—99．6311．65

從表3可以看出，硅膠層析時(shí)，厚樸酚較和厚樸酚先流出硅膠柱.厚樸酚樣品純度達(dá)到96%以上的收率為17%，而和厚樸酚樣品的純度只有86%～92%，分離效果不好.從色譜圖3中可以看出，厚樸酚、和厚樸酚只有一個(gè)色譜峰，但是峰型不好，拖尾非常嚴(yán)重，分離時(shí)間長(zhǎng)，不適合作為中壓硅膠層析流動(dòng)相.層析時(shí)所得樣品的顏色為白色和淺黃色.

表3 石油醚-乙酸乙酯流動(dòng)相的層析分離結(jié)果Tab.3 Separation effect of Magnolol and Honokiol mixture using petroleum ether-ethyl acetate as deneloping solvent

從表4可以看出，硅膠層析時(shí)，厚樸酚較和厚樸酚先流出硅膠柱.厚樸酚樣品純度達(dá)到96%以上的收率為17.03%，而和厚樸酚樣品的純度只有85%左右，分離效果不好.從色譜圖4中可以看出，厚樸酚、和厚樸酚只有一個(gè)色譜峰，但是色譜峰出現(xiàn)時(shí)間早，而且有點(diǎn)拖尾，分離效果不好，不適合作為中壓硅膠層析流動(dòng)相.層析時(shí)所得樣品的顏色為淺黃色.

從表2-4可以看出，60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇流動(dòng)相體系分離效果最好，通過(guò)層析就能使厚樸酚的純度達(dá)到96%以上，和厚樸酚的純度達(dá)到98%以上，收率為30%，而且樣品的顏色為白色和淺黃色，色譜峰拖尾不嚴(yán)重，節(jié)省了分離時(shí)間.而石油醚-乙酸乙酯、苯-甲醇體系的分離效果不好，厚樸酚、和厚樸酚的樣品純度不高，樣品顏色不好，而且色譜峰拖尾嚴(yán)重，增加了分離的時(shí)間.

表4 苯-甲醇流動(dòng)相的層析分離結(jié)果Tab.4 Separation effect ofMagnolol and Honokiol mixture using benzene-methanol as deneloping solvent

2.3.2 不同流動(dòng)相的流速對(duì)分離效果影響 實(shí)驗(yàn)中考察了30 mL/min和40 mL/min流動(dòng)相的流速對(duì)厚樸酚及和厚樸酚的分離效果.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，先用60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)流動(dòng)相平衡硅膠柱，待基線平穩(wěn)時(shí)進(jìn)行層析.濕法上樣，樣品用相應(yīng)的流動(dòng)相溶解，厚樸酚及和厚樸酚混合物的上樣量為3.0 g，層析時(shí)的流速分別為30 mL/min和40 mL/min，用紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并用色譜工作站對(duì)圖譜進(jìn)行分析處理.層析開始時(shí)，按每5 min分段收集流出液，當(dāng)出現(xiàn)厚樸酚的色譜峰時(shí)，按每2 min分段收集流出液，直至色譜峰完全收集完畢.收集好的樣品先用TLC進(jìn)行分析，合并具有相同成分和純度的樣品，減壓回收溶劑，干燥，即得到厚樸酚、和厚樸酚樣品，最后用HPLC分析其純度，并且計(jì)算產(chǎn)品的收率.不同層析流動(dòng)相的流速對(duì)厚樸酚及和厚樸酚的分離效果見表5和表6.

表5 流速為30 mL/min時(shí)的層析結(jié)果Tab.5 Separation effect of Magnolol and Honokiol mixture using 30 mL/min as flow velocity

表6 流速為40 mL/min時(shí)的層析結(jié)果Tab.6 Separation effect of Magnolol and Honokiol mixture using 40 mL/min as flow velocity

從表5-6可以看出，層析時(shí)，厚樸酚較和厚樸酚先流出硅膠柱.二者具有相似的分離行為，厚樸酚通過(guò)中壓硅膠層析的純度可以達(dá)到96%以上，收率35%，為了達(dá)到更高的純度，厚樸酚樣品需要通過(guò)重結(jié)晶進(jìn)一步純化；和厚樸酚純度大于98%，收率30%左右.從二者的色譜圖中可以看出，厚樸酚、和厚樸酚都只有一個(gè)色譜峰，但是，流動(dòng)相流速大時(shí)，厚樸酚流出所需的時(shí)間短，反之亦然，而且流動(dòng)相流速大時(shí)，可以節(jié)約分離時(shí)間和溶劑消耗，所以40 mL/min比30 mL/min流速分離效果好.

2.3.3 不同上樣量對(duì)分離效果影響 實(shí)驗(yàn)中考察了不同上樣量對(duì)厚樸酚及和厚樸酚的分離效果.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，先用60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)流動(dòng)相平衡硅膠柱，待基線平穩(wěn)時(shí)進(jìn)行層析.濕法上樣，樣品用流動(dòng)相溶解，厚樸酚及和厚樸酚混合物的上樣量分別為1.60、3.22、4.65和5.85 g，層析時(shí)的流速為40 mL/min，層析壓力為3.2～4.5 kgf/cm2，用紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并用色譜工作站對(duì)圖譜進(jìn)行分析處理.層析開始時(shí)，按每5 min分段收集流出液，當(dāng)出現(xiàn)厚樸酚的色譜峰時(shí)，按每2 min分段收集流出液，直至色譜峰完全收集完畢.收集好的樣品先用TLC進(jìn)行分析，合并具有相同成分和純度的樣品，減壓回收溶劑，干燥，即得到厚樸酚、和厚樸酚樣品，最后用HPLC分析其純度，并且計(jì)算產(chǎn)品的收率.不同層析流動(dòng)相的分離效果見表7-10.

表7 上樣量為1.60 g時(shí)的層析結(jié)果

表8 上樣量為3.22 g時(shí)的層析結(jié)果

表9 上樣量為5.85 g時(shí)的層析結(jié)果

表10 上樣量為4.65 g時(shí)的層析結(jié)果

從表7-10可以看出，在上樣量為1.60 g和3.22 g時(shí)，層析后的厚樸酚的純度達(dá)到96%，和厚樸酚的純度達(dá)到98%以上，分離效果較好；而上樣量為4.65 g和5.85 g時(shí)，厚樸酚、和厚樸酚樣品的純度均均較低，說(shuō)明分離效果不好.在上樣量為1.60 g時(shí)，96%以上純度的厚樸酚樣品質(zhì)量為0.42 g，98%以上純度的和厚樸酚樣品質(zhì)量為0.73 g；在上樣量為3.22 g時(shí)，96%以上純度的厚樸酚樣品質(zhì)量為1.12 g，98%以上純度的和厚樸酚樣品質(zhì)量為1.06 g，說(shuō)明，上樣量為3.22 g時(shí)比上樣量1.60 g時(shí)更經(jīng)濟(jì).綜上，上樣量為3 g左右是最佳的上樣量.

2.4 重結(jié)晶純化厚樸酚樣品

通過(guò)硅膠層析分離后的和厚樸酚樣品的純度可以達(dá)到98%以上，但是厚樸酚樣品的純度只能達(dá)到92%～96%，有些和厚樸酚樣品的純度也只有92%左右，為了能夠提高厚樸酚、和厚樸酚樣品的純度，需要進(jìn)一步對(duì)厚樸酚樣品進(jìn)行重結(jié)晶純化，以期達(dá)到98%以上的純度.

重結(jié)晶的溶劑主要有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚等.重結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的原料為上述厚樸酚純度92%～94%的樣品、和厚樸酚純度92%的樣品.分別稱取適量的樣品，用重結(jié)晶溶劑在50℃溶解，加入的溶劑量令樣品剛好溶解并處于飽合狀態(tài)，把溶解液放入0℃～4℃冰箱中冷藏24 h，然后分離晶體和結(jié)晶母液，洗滌，真空干燥得厚樸酚、和厚樸酚重結(jié)晶樣品.重結(jié)晶實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表11.

表11 重結(jié)晶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表11可以看出，厚樸酚在80%、85%和90%甲醇中均能夠重結(jié)晶，而且重結(jié)晶后的純度可以達(dá)到98%以上，在85%甲醇中重結(jié)晶時(shí)的收率最高，說(shuō)明該重結(jié)晶溶劑最佳.而和厚樸酚在80%、85%和90%甲醇中不能析出晶體，故不能作為結(jié)晶溶劑.和厚樸酚在石油醚、石油醚-乙酸乙酯中雖然能夠析出晶體，但是其中厚樸酚也同樣能夠析出晶體，這樣就不能通過(guò)重結(jié)晶的方法把和厚樸酚樣品進(jìn)一步進(jìn)行提純.

上述層析和重結(jié)晶操作單元中未達(dá)到純度要求的厚樸酚、和厚樸酚樣品，回收后再進(jìn)行硅膠層析和重結(jié)晶純化，能夠制備98%純度的厚樸酚、和厚樸酚單體，提高了產(chǎn)品的收率.

3 結(jié)論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可知，中壓硅膠層析分離厚樸酚及和厚樸酚混合物時(shí)，流動(dòng)相為60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)，流速為40 mL/min，上樣量為3.0～3.2 g，層析時(shí)壓力為3.2～4.5 kgf/cm2，用紫外檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，并用色譜工作站對(duì)圖譜進(jìn)行分析處理.由于通過(guò)硅膠層析不能把厚樸酚、和厚樸酚分離成兩個(gè)單獨(dú)的色譜峰，即不能把二者完全分開，所以需要分段收集流出液，用TLC分析后，合并成分相同的樣品，回收溶劑，真空干燥后可以得到厚樸酚純度大于96%、和厚樸酚純度大于98%的樣品.通過(guò)硅膠層析后的厚樸酚樣品用85%甲醇進(jìn)行重結(jié)晶后，純度大于98%，重結(jié)晶收率大于80%，達(dá)到純度要求.

在硅膠層析和重結(jié)晶操作單元中未達(dá)到純度要求的厚樸酚、和厚樸酚樣品，回收后再進(jìn)行硅膠層析和重結(jié)晶進(jìn)一步純化，能夠制備98%純度的厚樸酚、和厚樸酚單體，提高了產(chǎn)品的收率.

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