肺表面活性物質(zhì)蛋白B基因多態(tài)性與新生兒呼吸窘迫綜合征易感性的研究

曾凌空 李文斌 潘 睿 單瑞艷 周玉榮 張 佳 常立文

新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)是新生兒期常見的肺部疾患，多見于早產(chǎn)兒,且胎齡越小發(fā)病率越高。歐洲2010年頒布的NRDS指南[1]顯示，NRDS發(fā)病率在胎齡30～31周為52%，28～29周為74%，26～27周為88%，23～25周高達(dá)91%。NRDS發(fā)病機(jī)制是肺泡表面活性物質(zhì)缺乏。晚近較多研究關(guān)注基因?qū)RDS發(fā)病的影響，有研究表明肺泡表面活性物質(zhì)蛋白B(SPB)基因多態(tài)性是發(fā)生NRDS的危險(xiǎn)因素之一[2]。SPB-18基因位于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游，是一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)啟動(dòng)信號(hào)，能影響轉(zhuǎn)錄功能，使SPB的分泌水平產(chǎn)生變化；SPB1580C/T多態(tài)性可改變N端糖基化位點(diǎn)，對(duì)SPB的加工處理過(guò)程有影響，可導(dǎo)致SPB蛋白功能改變，SPB前蛋白在不成熟肺組織中表達(dá)較高，且受SPB1580基因調(diào)控。SPB-18A/C和SPB1580C/T基因多態(tài)性可影響患兒肺組織中SPB水平，可能與NRDS發(fā)病有關(guān)，但SPB基因多態(tài)性存在人種差異。本研究通過(guò)探討上述兩個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性與NRDS易感性的關(guān)系，為NRDS的診治提供新的理論依據(jù)。

1 方法

本研究為病例對(duì)照研究，收集NRDS的診斷病例，并按1∶2比例收集胎齡和出生體重相匹配的無(wú)明顯感染癥狀早產(chǎn)兒為對(duì)照組。納入的病例均獲得家長(zhǎng)知情同意。

1.1 NRDS組納入標(biāo)準(zhǔn) ①在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院住院的漢族NRDS患兒；②NRDS診斷符合歐洲2010年頒布的NRDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]:生后12 h內(nèi)開始進(jìn)行性呼吸困難加重，吸空氣PaO2<50 mmHg,有中心性發(fā)紺或需要吸氧才能維持PaO2>50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，同時(shí)胸部X線片提示毛玻璃樣改變、支氣管充氣征和“白肺”等特異性表現(xiàn)。

1.2 對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn) ①胎齡<36周因新生兒黃疸住院的患兒，按胎齡和出生體重與NRDS組患兒匹配；②胸部X線片提示無(wú)肺部感染和NRDS表現(xiàn)；③血常規(guī)和CRP檢查提示無(wú)明確感染者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) NRDS組和對(duì)照組均排除：①嚴(yán)重先天性疾病，如復(fù)雜型先天性心臟病、膈疝和腦發(fā)育不良等；②遺傳代謝性疾病，如苯丙酮尿癥、先天性甲狀腺功能低下和糖尿病等；③母親孕后期明確感染史，新生兒生后IgM升高。

1.4 DNA提取 DNA由外周血白細(xì)胞中提取，采用經(jīng)典酚提取法。3 mL血中加入2 mL PBS 混勻，3 000 r·min-1離心15 min，棄上清，向沉淀加入300 μL細(xì)胞裂解液 ，37℃水浴60 min，再加入20%十二烷基硫酸鈉50 μL和蛋白酶K(20 mg·mL-1)10 μL水浴過(guò)夜。次日取經(jīng)消化的細(xì)胞液300 μL，按31∶1加入酚-氯仿-異戊醇(251∶241∶1)，混勻10 min，3 000 r·min-1離心10 min，將上層水相移入另一EP管中重復(fù)抽提1次。取上層水相再用200 μL氯仿抽提1次，離心后，取上層水相加入2倍體積冷凍無(wú)水乙醇及1/30體積2 mmol·L-1醋酸鈉，析出DNA，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，以70%乙醇洗滌DNA 2次，加入30～50 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸充分溶解DNA,采用分光光度法測(cè)定DNA濃度，分裝，-20℃保存。

1.5 單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析 采用PCR-RFLP及基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)SPB-18A/C及SPB1580C/T多態(tài)性。

SPB-18引物上游5′-GTCCAGCTATAAGGGGCCGTG，下游GTGAGTGGTGGAGCTGCCTA。反應(yīng)體系：PCR 2×Mix 10 μL(DBI公司),模板DNA 0.8 μL，上下游引物各1.0 μL，去離子水10 μL。PCR條件:95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，70℃ 1 min，退火溫度從60℃降至55℃，每個(gè)循環(huán)降1℃ ，5個(gè)循環(huán),重復(fù)1次;95℃ 30 s，55℃ 1 min，70℃ 1 min，共29個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。SPB-18 酶切:反應(yīng)體系為Apapl酶0.5 μL(Takara公司10 U·μL-1),10×buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，去離子水20 μL，37℃消化6～12 h。

SPB1580引物上游：5′-CTCGAATTCACTCGTGA-ACTCCAGCACCC-3′，下游：5′- GTGAGCTTGCAGCCCTCTC-A-3′。 PCR反應(yīng)體系: PCR 2×Mix 10 μL,模板DNA 1.2 μL，上下游引物各0.8 μL，去離子水10 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 45 s, 退火溫度67℃至58℃， 72℃ 1 min，每個(gè)循環(huán)降1℃，共10個(gè)循環(huán)；95℃ 45 s，57℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min延伸。SPB1580酶切：酶切反應(yīng)體系為DdeⅠ酶0.25 μL (Toyobo公司10 U·μL-1)，PCR產(chǎn)物6 μL，10×buffer 3 μL，去離子水20 μL,37℃消化4～6 h。

電泳：上述產(chǎn)物酶切后取15 μL酶消化產(chǎn)物與3 μL 6×上樣緩沖液混合，分別上樣于15% (SPB-18)和8% (SPB1580)聚丙烯酰胺凝膠， 120 V恒壓電泳1.5～2.5 h，硝酸銀染色后參照DNA相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)電泳條帶判斷基因型，如圖1所示。

圖1 SPB1580和 SPB-18酶切后聚丙烯膠電泳圖

Fig 1 PAGE of SPB1580 and SPB-18 after enzymolysis

Notes A:SPB1580, bands 3 and 5 showed CT genotype, the lengths of the fragments were 185 bp, 165 bp, 85 bp and 20 bp; band 2 showed CC genotype(165 bp, 85 bp and 20 bp); bands 1 and 4 showed TT genotype(185 bp and 85 bp); B:SPB-18, bands 1, 2, 4 and 5 showed AA genotype, the lengths of the fragments were 146 bp and 21 bp; band 3 showed AC genotype(167 bp, 146 bp and 21 bp); band 6 showed CC genotype(167 bp)

基因測(cè)序： 從基因酶切結(jié)果中隨機(jī)選取20%樣本進(jìn)行基因測(cè)序，以驗(yàn)證PCR-RFLP結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)，以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確定樣本的群體代表性。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2008年5月至2010年5月進(jìn)入本文分析的NRDS患兒91例，其中男51例、女40例；基因檢測(cè)時(shí)年齡(31.3±3.6)周，體重(1 320±308)g。對(duì)照組182例，其中男98例、女84例；基因檢測(cè)時(shí)年齡(31.9±4.2)周，體重(1 335±317)g。兩組性別、基因檢測(cè)時(shí)年齡和體重均具可比性(P>0.05)。

2.2 SPB-18和SPB1580基因多態(tài)性分布結(jié)果代表性 本組中SPB-18和SPB1580基因多態(tài)性分布的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2分別為0.77和0.73，均P>0.05,符合Hardy-Weinberg平衡，說(shuō)明研究人群具有代表性。基因測(cè)序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果無(wú)差異。

2.3 SPB-18A/C多態(tài)性在NRDS和對(duì)照組分布 表1所示，NRDS組AA、AC和CC基因型頻率分別為11.0%、40.7%和48.4%，對(duì)照組分別為6.6%、31.1%和62.1%,兩組3種基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NRDS組A等位基因頻率為31.3%，對(duì)照組為22.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 SPB1580T/C多態(tài)性在NRDS和對(duì)照組分布 表2所示，NRDS組TT、CT和CC基因型頻率分別為5.5%、30.8%和63.7%，對(duì)照組分別為6.6%、45.1%和48.4%,兩組3種基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NRDS組C等位基因頻率為79.1%，對(duì)照組為70.9%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SPB-18多態(tài)性在NRDS和對(duì)照組的分布[n(%)]

Tab 1 The distributions of genotype and allale of SPB-18 in NRDS and control groups[n(%)]

GroupsAllelefrequencyAAACCCGenotypefrequencyACControl125711381283(n=182)(6.6)(31.3)(62.1)(22.3)(77.7)NRDS10374457125(n=91)(11.0)(40.7)(48.4)(31.3)(68.7)χ24.9825.280P0.0830.022

表2 SPB1580多態(tài)性在NRDS和對(duì)照組的分布[n(%)]

Tab 2 The distributions of genotype and allale of SPB1580 in NRDS and control groups[n(%)]

GroupsAllelefrequencyTTCTCCGenotypefrequencyTCControl128288106258(n=182)(6.6)(45.1)(48.4)(29.1)(70.9)NRDS5285838144(n=91)(5.5)(30.8)(63.7)(20.9)(79.1)χ25.8754.244P0.0530.039

2.5 不同種族SPB-18 A等位基因頻率分布 本研究漢族人、巴西人[3]、美國(guó)人[4]和丹麥人[5]SPB-18等位基因A頻率分別為31%(57/182頻次)、58%(174/300頻次) 、57%(249/436頻次)和61%(12 490/20 462頻次)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 不同種族SPB1580 C等位基因頻率分布 本研究漢族人、美國(guó)人[6]、巴西人[3]和丹麥人[5]SPB1580等位基因C頻率分別為79%(144/182頻次)、35%(278/804頻次)、41%(126/300頻次)、46%(9 389/20 462頻次)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與日本人群[7]等位基因C頻率(72%，345/482頻次)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

肺泡表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白(SPs)包括SPA、SPB、SPC和SPD。其中SPB雖然僅占所有表面活性物質(zhì)的2%，卻有不可替代的作用。遺傳性的SPB缺乏是致命的。在活體內(nèi)給予抗SPB抗體可致NRDS。在SPs缺乏的動(dòng)物模型中，給予SPB治療可改善肺順應(yīng)性和氧合作用。研究表明SPB在體外有許多生理學(xué)活性，如促進(jìn)磷脂在液氣表面吸附，穩(wěn)定單分子層的表面活性劑膜，在塌陷肺泡表面膜的再分布等[8]。

有研究表明，SPB基因多態(tài)性與NRDS易感性相關(guān)[9～11]。SPB基因的多態(tài)性位點(diǎn)目前研究最多的是SPB-18C/A、 1013C/A、 1580C/T、和9306A/G[12,13]。本研究的靶基因位點(diǎn)SPB-18是GC豐富的重復(fù)片段,位于TATA BOX側(cè)方，重復(fù)片段的上游一半在-35位點(diǎn)與SP1聯(lián)接[13,14]。SPB-18基因位于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游，TATA box下游15 bp,是一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)啟動(dòng)信號(hào)，能影響轉(zhuǎn)錄功能，使SPB蛋白的分泌水平產(chǎn)生變化。有研究應(yīng)用熒光標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)C等位基因比A的轉(zhuǎn)錄效率更高，并發(fā)現(xiàn)SP1與C等位基因結(jié)合比A等位基因更緊密。基因型為CA的正常志愿者肺泡灌洗液中SPB水平比AA者高2.6倍。AA基因型人群肺泡灌洗液中SPB水平較低[4]。 SPB1580C/T多態(tài)性可改變N端糖基化位點(diǎn)。等位基因位為C(ACT,蘇氨酸)時(shí)，在天冬酰胺129-谷氨酰胺130-蘇氨酸131(ACT)處有糖基化位點(diǎn)，等位基因?yàn)門(ATT，異亮氨酸)時(shí)，則無(wú)糖基化位點(diǎn)。氨基末端糖基化對(duì)SPB的加工處理、分泌和折疊等過(guò)程均有影響，可導(dǎo)致SPB蛋白水平和功能改變[15]。SPB前蛋白在不成熟肺組織中高，且受SPB1580基因調(diào)控[16]。這兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性可影響患兒肺組織中SPB蛋白水平，可能與NRDS發(fā)病有關(guān)。

本研究結(jié)果可見，NRDS組SPB-18 A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(31.3%vs22.3%)；SPB1580 C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(79.1%vs70.9%)，提示該2個(gè)基因多態(tài)性是NRDS發(fā)病的危險(xiǎn)因素，這與巴西的研究結(jié)果不一致[17]。引起NRDS發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能是多個(gè)因素共同決定。有病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)在NRDS患兒中SPB內(nèi)含子4長(zhǎng)度多態(tài)性與SPA基因多態(tài)性協(xié)同變化比其單獨(dú)變化顯著，提示SPB和SPA可能共同作用于NRDS發(fā)病。另外發(fā)現(xiàn)SPB-18A/C和SPB1013存在不平衡的連鎖關(guān)系，SPB-18位的A和1013C/A位點(diǎn)的C連鎖 。Floros 等[2]的家族相關(guān)性研究觀察了132個(gè)家庭，每個(gè)家庭至少有1例新生兒患NRDS,進(jìn)行多等位基因家系相關(guān)性分析，該研究NRDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)臨床指標(biāo)，對(duì)胸部X線片的特異性表現(xiàn)沒(méi)有嚴(yán)格要求，但統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)較嚴(yán)格。該研究發(fā)現(xiàn)NRDS 保護(hù)基因?yàn)镾PB-18A/1013C/1580T/9306G， SBP-18A/1013A/1580T/9306A。易感基因?yàn)镾BP-18A/1013C/1580T/9306A[21]。以上研究提示遺傳因素與NRDS發(fā)病的聯(lián)系是多樣的和協(xié)同的。不同種族人群中SPB-18A/C和SPB1580C/T基因多態(tài)性分布顯著不同。本研究文獻(xiàn)復(fù)習(xí)其他種族SPB基因多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)本研究漢族人SPB1580 C、SPB-18A等位基因頻率與美國(guó)、丹麥和巴西人差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SPB1580C等位基因頻率與日本人群差異不顯著。提示同位于東亞地區(qū)的中國(guó)和日本，由于地域和人種上較為接近，SPB-18A等位基因頻率可能不存在明顯的差異；而美國(guó)、丹麥和巴西人群與本研究漢族人群差異顯著。

本文的初步研究發(fā)現(xiàn)，SPB-18A/C和SPB1580C/T基因多態(tài)性與NRDS發(fā)病的聯(lián)系，但仍存在一定的不足之處和局限性：本研究樣本量有限，盡管研究者盡量平衡引起NRDS的其他危險(xiǎn)因素，比如胎齡、出生體重等，結(jié)果仍可能產(chǎn)生一定的偏倚。理想的遺傳關(guān)聯(lián)性研究樣本量應(yīng)在1 000例以上。國(guó)外的多項(xiàng)研究結(jié)論亦不盡相同，除了與以上因素有關(guān)外，還與不同人種的基因差異有關(guān)。下一步將應(yīng)用家系為基礎(chǔ)的相關(guān)性研究，如傳遞不平衡分析等。擴(kuò)大樣本量，探討NRDS與SPB上多基因位點(diǎn)及SPB與其他SP基因協(xié)同作用的關(guān)系。

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