李瑩娟

（昆明法醫(yī)院司法鑒定中心，云南 昆明 650033）

1 案例資料

1.1 簡要案情

我鑒定中心2019 年在日常鑒定工作中，對1 例二聯(lián)體親子鑒定進(jìn)行鑒定分析時，發(fā)現(xiàn)被檢父的STR分型圖上，Amelogenin 基因座僅檢出Amel-Y 等位基因，未檢出Amel-X 等位基因，我們分別使用4 個試劑公司不同的試劑盒進(jìn)行了分析，現(xiàn)報道如下。

1.2 檢驗方法

按照中華人民共和國公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T383-2014 附錄A 中的Chelex 法提取檢材DNA，初次檢驗使用美國Promega 公司PowerplexR21 system試劑盒，再次檢驗使用的是海爾施基因科技公司SureIDRPanGlobal 試劑盒，蘇州閱微基因公司的MicroreaderTM19X ID system 試劑盒和北京基點認(rèn)知技術(shù)公司的GoldeneyeR17X 試劑盒對檢材提取到的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物用美國ABI3130 遺傳分析儀進(jìn)行檢測，Genemapper ID-X 1.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 檢驗結(jié)果

PowerplexR21 system 試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物，Amelogenin 基因座僅檢出Amel-Y 等位基因，而Amel-X 等位基因丟失（見圖1）。SureIDRPanGlobal試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物，Amelogenin 基因座檢出Amel-X等位基因，Amel-Y 等位基因，但峰高不均衡，Amel-X 等位基因峰高低于Amel-Y 等位基因峰高的30%（見圖2）。MicroreaderTM19X ID system 試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢出全部18 個X-STR 基因座的等位基因分型，Amelogenin 基因座檢出Amel-X 等位基因，Amel-Y 等位基因，但峰高不均衡，Amel-X 等位基因峰高低于Amel-Y 等位基因峰高的40%（見圖3）。GoldeneyeR17X 試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢出全部16 個X-STR 基因座的等位基因分型，且Amelogenin 基因座Amel-X 等位基因，Amel-Y 等位基因分型完整，峰高均衡（見圖4）。

圖1 PowerplexR21 system 試劑盒的檢測結(jié)果

圖2 SureIDRPanGlobal 試劑盒的檢測結(jié)果

圖3 MicroreaderTM19X ID system 試劑盒的檢測結(jié)果

圖4 GoldeneyeR17X 試劑盒的檢測結(jié)果

2 分析討論

牙釉質(zhì)蛋白基因（Amelogenin,Amel），是編碼牙釉質(zhì)蛋白的基因，Amel-X 和Amel-Y 是Amelogenin 基因座的一對等位基因，分別位于X 染色體Xp22.1-Xp22.3 和Y 染色體Yp11.2[1]，通過設(shè)計引物，覆蓋X 或者Y 染色體內(nèi)含子或者外顯子內(nèi)不同的缺失，可以得到長度不同的Amel-X 等位基因和Amel-Y 等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用長度差異來進(jìn)行性別鑒定[2-3]。正常的女性為XX 的純合子，而正常男性為X 與Y 的雜合子。通過Amelogenin 基因座分型進(jìn)行性別鑒定已經(jīng)被廣泛用于法醫(yī)物證學(xué)檢驗。與其他基因座一樣，Amelogenin 基因座的檢測，也會出現(xiàn)異常現(xiàn)象，國內(nèi)外有許多關(guān)于Amelogenin 基因座Amel-X 等位基因或Amel-Y 等位基因丟失的報道[4-13]，出現(xiàn)Amel-X 等位基因或Amel-Y 等位基因丟失的主要原因和機(jī)制不完全相同。Y 染色體區(qū)域的缺失是Amel-Y 等位基因丟失的主要原因，此外，Amel-Y 引物結(jié)合區(qū)的點突變、染色體易位、XX 性反轉(zhuǎn)綜合征等遺傳性疾病均可導(dǎo)致Amel-Y 等位基因丟失。Amel-X 等位基因缺失的報道比較共同的認(rèn)知是由于DNA 模板在引物結(jié)合區(qū)的點突變，影響引物與DNA 模板的結(jié)合及DNA 鏈的延伸，無法擴(kuò)增出相應(yīng)等位基因片段，導(dǎo)致等位基因丟失[15-17]，或影響引物退火溫度使等位基因峰高不平衡，但突變類型及突變位置存在差異。較少情況下發(fā)生包含Amelogenin基因座的染色體片段的缺失。

本案中的被檢父，在初次用PowerplexR21 system試劑盒檢測時，未檢出Amelogenin 基因座Amel-X等位基因，我們做出了2 種假設(shè)：①由于模板DNA在引物結(jié)合區(qū)出現(xiàn)了點突變，影響了模板DNA 與引物結(jié)合或影響了DNA 鏈的延伸，而導(dǎo)致的Amel-X 等位基因丟失；②由于X 染色體的片段缺失而未能檢出Amel-X 等位基因。

而后，我們又用SureIDRPanGlobal試劑盒、Microreader TM19X ID system 試劑盒和GoldeneyeR17X 試劑盒進(jìn)行了分析，均得到了全部X-STR 基因座的等位基因分型和Amelogenin 基因座Amel-X 等位基因和Amel-Y 等位基因，未出現(xiàn)Amel-X 等位基因的缺失。由此推斷本案被檢父的Amel-X 等位基因的丟失，基本可以排除是因X 染色體片段缺失而導(dǎo)致的Amelogenin 基因座Amel-X 等位基因丟失。

且通過分析4 個不同試劑盒擴(kuò)增的被檢父樣本Amelogenin 基因座Amel-X 等位基因和Amel-Y 等位基因的片段大小和峰高比值，如表1 所示，我們有如下發(fā)現(xiàn)：①4 個試劑盒的Amel-X 等位基因和Amel-Y等位基因片段大小不相同，Amel-X 等位基因和Amel-Y 等位基因的分子量差也不相同，說明他們的引物設(shè)計是不相同的，通過改變引物設(shè)計，能夠得到全部的X-STR 基因座的等位基因分型和Amelogenin基因座Amel-X 等位基因和Amel-Y 等位基因，未出現(xiàn)Amel-X 等位基因的缺失，能夠支持模板DNA 在引物結(jié)合區(qū)出現(xiàn)了點突變的觀點。②GoldeneyeR17X 試劑盒的Amel-X 等位基因和Amel-Y 等位基因的分子量差與其余試劑盒的不同，Amel-X 等位基因得到了完全擴(kuò)增，說明GoldeneyeR17X 試劑盒與其他試劑盒不是針對同一位置設(shè)計的引物，推測該試劑盒的引物設(shè)計剛好避開了引物結(jié)合區(qū)的突變點，這也能夠支持模板DNA 在引物結(jié)合區(qū)出現(xiàn)了點突變的觀點。③SureIDRPanGlobal 試劑盒和MicroreaderTM19X ID system試劑盒雖然擴(kuò)增得到了Amel-X等位基因，但峰高極低，與Amel-Y 等位基因的比值不均衡，也印證了引物結(jié)合區(qū)的點突變影響引物的退火溫度使等位基因的峰高不均衡的說法。

表1 4 個試劑盒被檢父樣本Amel-X 和Amel-Y 的片段大小和峰高比值

綜上所述，本案被檢父Amelogenin 基因座Amel-X 等位基因丟失的原因，筆者認(rèn)為是第一種假設(shè)成立。

Amelogenin 基因座作為常染色體STR 基因座的輔助判定，在一些特殊和復(fù)雜鑒定中具有重要意義，本案報道的此類樣本模板DNA 在引物結(jié)合區(qū)發(fā)生點突變的情況即可導(dǎo)致Amel-X 等位基因丟失，也可導(dǎo)致Amel-Y 等位基因丟失。本案被檢父丟失的是Amel-X 等位基因，沒有影響性別的判斷，但如果出現(xiàn)的是Amel-Y 等位基因丟失，很有可能造成男性誤判成為女性的情況，此類情況如果發(fā)生在案件現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的檢材上，錯誤的性別判斷，會誤導(dǎo)案件方向，造成嚴(yán)重的后果。因此，在日常鑒定工作中，應(yīng)用商品化試劑盒進(jìn)行檢測和分析時，如果出現(xiàn)Amelogenin 基因座異常缺失的情況，應(yīng)該引起鑒定人的重視，使用多個試劑盒進(jìn)行反復(fù)驗證，條件允許的情況下，還應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行測序分析，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，排除錯判的風(fēng)險。