崔 娓

（珠海市婦幼保健院檢驗科，廣東 珠海 519001）

C反應(yīng)蛋白（C reation protein，CRP）是一種急性時相反應(yīng)蛋白，在急性和慢性感染、創(chuàng)傷、腫瘤、心肌梗塞時其血濃度急劇升高，檢測CRP對臨床診斷有重要參考價值[1]。目前，我國臨床實驗室測定血清特定蛋白的方法主要有兩種，一種為透射比濁法，另一種為散射比濁法。西門子BNII全自動特定蛋白分析儀用散射比濁法測定CRP，國內(nèi)較少應(yīng)用此方法。筆者參考美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)文件及相關(guān)文獻并結(jié)合實際工作[2-4]，探討了DADE Behring Nephelometer II(BNII)散射比濁法檢測CRP的方法學性能驗證方案和評價方法，結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 BNII全自動特定蛋白分析儀，西門子原裝CRP試劑、校準品，低、高值質(zhì)控品，Roche Modular全自動生化分析儀，羅氏原裝CRP試劑、校準品，質(zhì)控品，Sysmex A-PLUS干擾試劑盒。

1.2 標本 標本來源于就診患者新鮮血清、無溶血、黃疸和脂血。

1.3 評價方案

1.3.1 精密度核實實驗[5]按照操作說明書對儀器進行維護保養(yǎng)、校準和質(zhì)量控制，按EP-15A文件要求計算需要重復(fù)測試的天數(shù)和次數(shù)(如果σwithin＜2/3σtotal實驗應(yīng)持續(xù)5 d，每批每個水平重復(fù)測定4次；如果σwithin＞2/3σtotal實驗應(yīng)持續(xù)3 d，每批每個水平重復(fù)測定3次；如果σwithin與σtotal相對關(guān)系未知，每個水平重復(fù)4次，持續(xù)5 d。σwithin和σtotal分別用來表示廠家聲明的批內(nèi)標準差和總標準差），按上述設(shè)計的天數(shù)和重復(fù)次數(shù)測定標本，將結(jié)果詳細記錄并依文件進行數(shù)據(jù)處理，分別計算Swithin和Stotal(Swithin和Stotal分別用來表示用戶測定的批內(nèi)標準差和總標準差)，與廠家聲明的σwithin和σtotal進行比較。核實批內(nèi)精密度：如果Swith＜σwithin，用戶核實了與廠家聲明一致的精密度；如果Swith＞σwithin，有可能這種差異無統(tǒng)計學意義，需要進行驗證，若Swith小于驗證值，廠家聲明的批內(nèi)精密度通過驗證。核實總精密度：如果Stotal＜σtotal，用戶核實了與廠家聲明一致的精密度；如果Stotal＞σtotal，有可能這種差異無統(tǒng)計學意義，需要進行驗證，若Stotal小于驗證值，廠家聲明的批內(nèi)精密度通過驗證。

1.3.2 準確度核實實驗 用批號為183843的校準品校準檢測系統(tǒng)后，在對同一批號和不同批號(183842)的校準品進行檢測，檢測結(jié)果與各自的標示值(靶值)進行比對(2個批號校準品均為儀器配套校準品，其校準值可溯源至WHO中人CRP參考資料)。

1.3.3 比對實驗[6]每天選取8份臨床患者新鮮樣本，分別在羅氏Modular PPI全自動生化分析儀和西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀上按1→8再8→1的順序進行CRP的雙份平行測定，分5個工作日完成40份樣本的測定。組內(nèi)離群值檢查:以絕對差值均值的4倍作為每個檢測方法的“可接受”限，以相對差值均值的4倍作為標準化的檢測界限，如果有一個值超過上述“可接受”限或相對范圍的檢測界限，檢查原因，并從數(shù)據(jù)中刪除此值。從數(shù)據(jù)中刪除的離群值不得超過一個。數(shù)據(jù)作圖：以待評方法(BNⅡ)的結(jié)果為Y，以比較方法(羅氏)的結(jié)果為X做散點圖。方法間離群值檢查：分別以4ē和4ē'作為檢測限和相對檢測限，任何一點入未通過上述兩種檢測限，則判斷為離群值。每組數(shù)據(jù)中被刪除得離群值不能超過2.5%。X值合適范圍檢驗：計算r或r2，如果r≥0.975(r2≥0.95)，則可認為X值取值范圍合適。如果r＜0.975，則使用部分個別差異法計算平均偏差。計算兩種方法的線性回歸方程，結(jié)果解釋：估算CRP在兩個不同醫(yī)學決定水平(12 mg/L和20 mg/L)的預(yù)期偏差、相對偏差和預(yù)期偏差95%的可信區(qū)間。以1/2 CLIA’88允許誤差作為臨床可接受標準，計算醫(yī)學決定水平(Xc)的允許誤差(EA)，將預(yù)期偏差的可信區(qū)間與醫(yī)學決定水平的EA相比較：當EA＞預(yù)期偏差可信區(qū)間的上限時，實驗方法與對比方法相當，偏差可以接受；當預(yù)期偏差可信區(qū)間的上限＞EA＞預(yù)期偏差可信區(qū)間的下限時，實驗方法與對比方法相當；當EA＜預(yù)期偏差可信區(qū)間的下限時，實驗方法與對比方法不相當，偏差不能被接受。

1.3.4 干擾實驗 參考EP7-A2文件[7]，首先進行配對差異實驗，即將陽性干擾物加入測定樣品中，與不加的對照組比較有無偏倚。如果無臨床顯著意義，則該物質(zhì)不是干擾物，無須進一步實驗；反之具有臨床顯著意義的，應(yīng)進行干擾劑量效應(yīng)評價實驗以確定干擾物濃度與干擾程度間的關(guān)系。

1.3.4.1 配對差異實驗 實驗材料：(1)基礎(chǔ)樣本：依據(jù)EP7-A2推薦的分析物濃度，CRP選擇約10 mg/L和40 mg/L的新鮮血清(無溶血、黃疸和脂血)作為基礎(chǔ)樣本，并重復(fù)測試10次，得到均值和批內(nèi)標準差S。(2)貯存液和空白液：A-PLUS試劑盒內(nèi)含游離膽紅素(F-Bil)、結(jié)合膽紅素(C-Bil)、血紅蛋白(Hb)、乳糜4種干擾物和空白對照凍干粉，復(fù)溶后分別作為貯存液和空白液。(3)測試樣本和對照樣本：依據(jù)實驗要求，用基礎(chǔ)樣本分別以1∶9、1∶5、1∶10、1∶20比例稀釋4種干擾物的貯存液和空白液作為測試樣本(C)和對照樣本(T)，其中F-Bil、C-Bil、Hb添加的量為樣本中可能出現(xiàn)的最高濃度。

1.3.4.2 重測次數(shù)n的確定(95%的置信區(qū)間)首先計算dmax/s(最大允許干擾值/批內(nèi)標準差)比值，然后查表1，獲得實驗需要的重測次數(shù)n。

表1 dmax/s與重測次數(shù)對應(yīng)表

1.3.4.3 點估計 將所得數(shù)據(jù)進行干擾效應(yīng)的“點估計”，即dobs(dobs=X檢測－X對照)與臨界值dc比較，如果點估計dobs≥dc，說明存在干擾。

1.3.4.4 干擾劑量效應(yīng)實驗 如果配對差異實驗存在干擾現(xiàn)象，利用5個系列濃度(L、75%L+25%H、50%L+50%H、25%L+75%H、H)確定其劑量效應(yīng)關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 精密度核實試驗結(jié)果 參考EP-15A，由于CRP檢測項目的σwithin與σtotal相對關(guān)系未知，則取高低兩個水平的質(zhì)控品，每個水平重復(fù)4次，持續(xù)5 d。低水平濃度質(zhì)控品Swithin和Stotal分別為0.46和0.58，批內(nèi)CV和總CV分別為3.32%和4.19%；批內(nèi)高水平濃度質(zhì)控品Swithin和Stotal分別為1.99和2.53，批內(nèi)CV和總CV分別為3.58%和4.55%。見表2。

2.2 準確度核實試驗 2個批號校準品的驗證值和靶值的相對偏差在6.05%～6.16%，見表3。

2.3 比對實驗 兩種方法內(nèi)和方法間離群點：CRP方法內(nèi)和方法間各有一離群點，按文件要求刪除。相關(guān)性：按EP9-A2文件要求，繪制透射比濁和散射比濁兩種方法測定CRP的散點圖。兩種方法的相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，線性回歸方程為y=0.952 7x+0.355 2(圖1)。偏差：在醫(yī)學決定水平1(12 mg/L)，預(yù)期偏差和相對偏差分別為-0.21和1.77%，預(yù)期偏差的95%可信區(qū)間為10.81～12.76；在醫(yī)學決定水平2(20 mg/L)，預(yù)期偏差和相對偏差分別為-0.59和2.95%，預(yù)期偏差的95%可信區(qū)間為18.43～20.38，見表4。

表2 精密度實驗結(jié)果(mg/L)

表3 校準品驗證結(jié)果(mg/L)

圖1 待評方法（BNII）均值對比較方法（Roche）均值的散點圖

表4 CRP測定的臨床可接受性能評價

2.4 干擾實驗 本實驗設(shè)定基礎(chǔ)樣本均值的12.5%為dmax，查dmax/s表可得n=3。配對差異實驗的結(jié)果顯示，F(xiàn)-Bil 0.2 g/L、C-Bil 0.4 g/L、Hb 4.82 g/L、乳糜835濁度對CRP檢測時干擾差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表5。

表5 干擾實驗結(jié)果

3 討 論

西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀檢測原理為免疫散射比濁法，具有較高的特異性和靈敏度。按照國家醫(yī)學實驗室認可(ISO15189)和CAP(College of American pathology)認可要求，實驗室需對使用的方法進行評價[8]。為證實西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀分析性能的可靠性，筆者參考CLSI文件及資料對此儀器進行初步的分析性能評價。

檢測系統(tǒng)最主要的性能指標是精密度和準確度[9-10]。臨床化學設(shè)備或檢測系統(tǒng)精密度的評價通常采用CLIS EP5-A文件，實驗結(jié)果顯示，CRP含量在13.84 mg/L和55.6 mg/L時批內(nèi)不精密度(CV)分別為3.32%和3.58%，總不精密度(CV)分別是4.19%和4.55%，與儀器說明書的精密度性能一致，達到CLIA’88允許誤差的1/3水平(允許不精密度＜8.33%)。準確度驗證實驗通常采用以下三種方法：(1)參考CLSI EP9-A2文件與參考方法或其他比較方法進行比對和偏倚評估。(2)對衛(wèi)生部檢驗中心發(fā)放的室間質(zhì)控品進行檢測，檢測結(jié)果與靶值進行比對。(3)用校準品檢測校準后，在對同一批號和不同批號的校準品檢測，結(jié)果與各自的標示值進行比較。本實驗參考CLSI EP15-A，采用不同批號校準品評價儀器的準確度性能，2個批號校準品的驗證值與“靶值”的偏倚在6.06%～6.16%，達到CLIA'88允許誤差的1/2水平(允許誤差＜12.5%)。

羅氏Modular全自動生化分析儀的透射比濁法主要檢測抗原抗體復(fù)合物所形成的濁度，西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀的散射比濁法是從不同角度測量抗原抗體復(fù)合物微粒的散射光強度和濁度的變化，兩法都屬于免疫比濁法[11]。比對實驗結(jié)果顯示在整個分析范圍內(nèi)，兩種方法測定結(jié)果的相對偏差為0.14%～21.21%，且CRP濃度較高時，兩種方法測定結(jié)果的相對偏差較小，均少于10%。在兩個醫(yī)學決定水平處，西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀的散射比濁法與羅氏Modular全自動生化分析儀的透射比濁法檢測結(jié)果相當，可以接受。

EP7-A2提供了兩種干擾分析方法：①干擾篩選；②用病人標本評價干擾。本實驗利用Sysmex公司的A-PLUS干擾試劑盒，采用干擾篩選方法評估臨床實驗室的主要干擾(黃疸、溶血和脂血)[12]。實驗結(jié)果表明F-Bil 0.2 g/L、C-Bil 0.4 g/L、Hb 4.82 g/L、乳糜835濁度對CRP檢測時干擾無統(tǒng)計學意義。證明該檢測系統(tǒng)檢測CRP的抗黃疸，溶血，脂血的能力較強。

綜上所述，西門子BNII全自動特定蛋白分析儀CRP檢測的主要分析性能符合質(zhì)量目標要求，可滿足臨床需要。

[1]王 慧,羅 煒,陳 濤.免疫透射比濁法CRP檢測試劑盒的性能評價[J].中國熱帶醫(yī)學,2006,6(8):1479-1480.

[2]徐國賓,蔡 琳.臨床生物化學常規(guī)定量方法的分析性能評價[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2007,30(6):718-720.

[3]李貴星,宋昊嵐.實驗方法的選擇與評價策略[J].四川醫(yī)學,2007,28(3):238-240.

[4]畢 波,呂 元.定量檢測方法學性能驗證的系統(tǒng)設(shè)計[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2007,30(2):143-145.

[5]CLSI,EP15-A.User Demonstration of Performance for Precision andAccuracy[S].2004.

[6]CLSI.EP9-A2,Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples[S].2002.

[7]CLSI.EP7-A2.Interference testing in clinical chemistry[S].2005.

[8]U.S.Department of Health and Human Services,Centers for Medicare&Medicaid Services(CMS),Centers for disease control and prevention.Medicare,Medicaid,and CLIA programs;Laboratory requirements relating to quality systems and certain personnel qualifications.Final Rule[S].Federal Register,2003,16:3640-3714.

[9]張秀明,莊俊華,鄭松柏,等.臨床化學發(fā)光免疫法檢測AFP的分析性能驗證與實驗方法[J].中華醫(yī)學檢驗雜志,2007,30(11):1293-1297.

[10]馮仁豐.臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)[M].2版.上海:上?？茖W技術(shù)文獻出版社,2007:85-92.

[11]孫 虹,王 凡,孫 鹥,等.透射和散射比濁法測定血清免疫球蛋白的評價[J].臨床檢驗雜志,2005,23(3):189-191.

[12]徐建華,黃憲章,莊俊華,等.羅氏Modular全自動生化分析儀酶學指標檢測性能驗證[J].檢驗醫(yī)學,2010,25(2):81-85.