周旋，倪茂巍，陳茂，朱忠欣，叢維濤，金利泰

凝膠電泳是分離蛋.白質(zhì)及多肽的一種強(qiáng)有力的生化分析工具。而蛋白質(zhì)染色在凝膠電泳系統(tǒng)中則是一個(gè)重要的組成部分，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展，凝膠蛋白質(zhì)染色技術(shù)已成為銜接二維電泳和下游質(zhì)譜分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，常用的凝膠上蛋白質(zhì)染色方法主要有染料染色法、銀染法、負(fù)染法和熒光染色法。本文對(duì)近幾十年來在凝膠上蛋白質(zhì)染色技術(shù)方面所取得的進(jìn)展和突破進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)未來的發(fā)展方向做出展望。

1 染料染色法

1.1 考馬斯亮藍(lán)染色法

由于考馬斯亮藍(lán)（CBBR 和 CBBG）具有成本低、操作便捷及質(zhì)譜兼容性好等特點(diǎn)，使得該類染料成為最常用的蛋白質(zhì)染色染料?？捡R斯染料最初是應(yīng)用于紡織工業(yè)中羊毛的染色，F(xiàn)azekas 等[1]在 1963 年首次將考馬斯亮藍(lán) R-250應(yīng)用于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上蛋白質(zhì)的染色，取得了較好的效果。隨即，考馬斯亮藍(lán) R-250和它的二甲基化衍生物考馬斯亮藍(lán) G-250 又被應(yīng)用于聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)染色[2]。在接下來的 20 多年中，不斷有研究者針對(duì)蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行優(yōu)化，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)如靈敏度、染色時(shí)間和凝膠背景都有一定程度的改善，但總體染色靈敏度還是較低，約為幾百納克到幾微克，染色時(shí)間較長(zhǎng)，且凝膠背景偏深[3-4]。

Neuhoff 等[5]開發(fā)的膠體考馬斯亮藍(lán)染色法，使考馬斯亮藍(lán)在染色液中形成膠束，從而有效提高了染色靈敏度，降低了凝膠背景，是考馬斯亮藍(lán)染色法優(yōu)化史上具有重大意義的改進(jìn)，通過該方法得到的染色靈敏度可以和銀染相媲美。Candiano 等[6]發(fā)明的“Blue Silver”考馬斯亮藍(lán)染色法是該類染色法中的又一大進(jìn)步，其靈敏度可達(dá) 2 ng/band。Pink等[7]在前人研究的基礎(chǔ)上，最近開發(fā)出了一種高靈敏和質(zhì)譜兼容性好的新型考馬斯亮藍(lán)染色法，通過改變?nèi)旧褐辛姿岬臐舛?，使得靈敏度達(dá)到 2 ng/band，同時(shí)質(zhì)譜兼容性也得到了很大提高。雖然考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)染色的原理尚未完全確定，但其可能機(jī)理主要為：考馬斯亮藍(lán)是二磺酸化的三苯甲烷類染料，其可通過染料的磺酸基和蛋白質(zhì)上質(zhì)子化的堿性氨基酸間以靜電力相結(jié)合。其次，還可通過染料的疏水性殘基和蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域的作用產(chǎn)生疏水性力，同時(shí)也存在氫鍵和范德華力的作用[5]。

1.2 離子對(duì)染料染色法

在蛋白質(zhì)染料染色的研究過程中，特別要指出的是離子對(duì)染色技術(shù)的提出，此項(xiàng)技術(shù)是蛋白質(zhì)染料染色法理論上的一大創(chuàng)新。該方法分別選用一陰離子染料和一陽離子染料同時(shí)做為蛋白質(zhì)的染色染料。在染色液中，由于陰陽離子相互結(jié)合作用，使部分染料以陰陽離子對(duì)形式存在，而離子對(duì)染料和游離的染料分子之間存在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，較大程度降低了染色液中游離染料的濃度，提高了游離染料分子和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率，降低凝膠背景，從而提高了染色靈敏度（圖 1）。陰離子染料通過自身的磺酸基和蛋白質(zhì)鏈上質(zhì)子化的氨基酸結(jié)合，而陽離子染料主要是通過與蛋白質(zhì)鏈上的帶負(fù)電荷的羧基相結(jié)合實(shí)現(xiàn)染色。前期 Jin 及其研究團(tuán)隊(duì)在蛋白質(zhì)離子對(duì)染色法的探索中做了大量的研究工作，如應(yīng)用0.003% 的陽離子染料乙基紫（ethyl violet，EV）和 0.004%陰離子染料巰氧吡啶鋅（zincon，ZC）組成 EZ 離子對(duì)染色液，在 1 h 內(nèi)即可完成染色操作，其靈敏度達(dá) 2 ～ 8 ng/band，高于現(xiàn)有的考馬斯亮藍(lán)染色法數(shù)倍[8-9]（圖 2）。同時(shí)，EZ染色法具有較淺的凝膠染色背景和優(yōu)良的質(zhì)譜兼容性，操作便捷，成本低，可較好地應(yīng)用于各類實(shí)驗(yàn)室的研究中。

圖 1 離子對(duì)檢測(cè)技術(shù)的推測(cè)機(jī)理圖

1.3 其他染料染色法

除考馬斯亮藍(lán)染色法外，Gorovsky 等[10]發(fā)現(xiàn)堿性孔雀綠對(duì)極端堿性的蛋白質(zhì)如組蛋白等有較好的染色效果。Hong 等[11]將鈣指示劑應(yīng)用于凝膠上的蛋白質(zhì)染色，鈣指示劑即可以加入到電泳液中使得蛋白質(zhì)在電泳的過程得到染色，電泳結(jié)束后就可直接觀察蛋白質(zhì)條帶，靈敏度達(dá)25 ng/band；同時(shí)也可以采用傳統(tǒng)的凝膠后染方法，即電泳結(jié)束后，再用染色液對(duì)凝膠染色，其靈敏度達(dá) 10 ng/band，超過考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏度。Jin 等[12]發(fā)現(xiàn)鈣指示劑和銀染法相結(jié)合可以提高蛋白質(zhì)銀染法的靈敏度并增加銀染的質(zhì)譜兼容性。

圖 2 EZ 染色法（A）與膠體考馬斯亮藍(lán)染色法（B）靈敏度比較圖

2 銀染法

銀染法主要是通過銀離子滲透進(jìn)入凝膠內(nèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合，再用還原劑將與蛋白質(zhì)相結(jié)合的銀離子還原為金屬銀，從而達(dá)到檢測(cè)蛋白質(zhì)的目的。銀染法的原理如下：在溶液條件下銀離子能與蛋白質(zhì)的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通過靜電力相結(jié)合；同時(shí)銀離子還可與組氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和賴氨酸上的咪唑、巰基、甲硫基和氨基結(jié)合。而與蛋白質(zhì)結(jié)合的銀離子可在甲醛等還原劑的還原作用下變?yōu)楹诤稚慕饘巽y使蛋白質(zhì)顯色。熱力學(xué)研究表明：膠表面結(jié)合或殘留的銀離子比與蛋白質(zhì)結(jié)合的銀離子更容易被還原為金屬銀，造成凝膠上蛋白質(zhì)的負(fù)染現(xiàn)象，但一般在凝膠顯影之前會(huì)有水洗步驟，可將膠面上未與蛋白質(zhì)結(jié)合的銀離子盡可能的洗脫掉。因此，蛋白質(zhì)銀染的重現(xiàn)性和背景的深淺很大程度上取決于顯影前的水洗步驟，如：水洗時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使銀染靈敏度低，水洗時(shí)間不足會(huì)造成凝膠背景加深。

根據(jù)銀染時(shí)溶液條件的不同，蛋白質(zhì)銀染法可分為酸性銀染法和堿性銀染法即銀氨法，酸性銀染法通常是將中性硝酸銀水溶液染色后的凝膠放在含甲醛的強(qiáng)堿性碳酸鹽類顯影液中顯影，而堿性銀染法一般是指將凝膠放在銀氨溶液中染色接著用含甲醛的檸檬酸液顯影。這兩種銀染法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如：酸性銀染法比堿性銀染法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但靈敏度沒有堿性銀染法高。雖然在所有染色方法中，銀染法的靈敏度是最高的，但其缺點(diǎn)也很明顯，如耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁多、線性范圍小和質(zhì)譜兼容性差等。圍繞銀染法的不足，科研工作者對(duì)該方法進(jìn)行了不斷的改進(jìn)，尤其是如何改進(jìn)蛋白質(zhì)銀染法的質(zhì)譜兼容性已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。銀染中醛類還原劑能與蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合，使蛋白質(zhì)甲基化，造成蛋白質(zhì)下游研究的質(zhì)譜兼容性降低。Shevchenko 等[13]用醇和酸的溶液代替以往醛類對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行固定，雖然靈敏度有一定的降低，但蛋白質(zhì)經(jīng)銀染后的質(zhì)譜兼容性得到了提高。Jin等[12,14]首先采用染料離子如鈣紅指示劑和鉻黑 T 作為銀染增敏劑，以減少顯影液里甲醛的用量，使得蛋白質(zhì)鑒定時(shí)質(zhì)譜兼容性得到大幅提高。Chevallet 等[15]發(fā)明的用還原糖代替甲醛的銀染方法也取得了較好的靈敏度與質(zhì)譜兼容性。

Jin 等[9]還在前人研究基礎(chǔ)上創(chuàng)建了 EZ-銀染雙重染色法，即用陰陽染料離子對(duì)完成第一步染料染色，靈敏度為2 ～ 8 ng/band，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可選擇性地進(jìn)一步進(jìn)行銀染，靈敏度可達(dá) 0.05 ～ 0.2 ng/band，為目前最靈敏的蛋白質(zhì)銀染法（圖 3）。由于染料分子中含偶氮鍵，在銀離子還原中可起到增敏的作用，因此降低了甲醛的使用量，增加了銀染法的質(zhì)譜兼容性（圖 4）。

圖 3 EZ-銀染法（A）與戊二醛銀染法（B）靈敏度比較圖

3 負(fù)染法

蛋白質(zhì)負(fù)染法的原理主要是：將金屬離子有選擇地沉淀在膠面上，而蛋白質(zhì)條帶不被染色。因此，蛋白質(zhì)所處區(qū)域是透明的，從而達(dá)到檢測(cè)目的。這種方法操作便捷，成本較低，但是該方法的對(duì)比度較差，且重現(xiàn)性受諸多因素的影響，因此限制了本方法的廣泛使用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了許多蛋白質(zhì)負(fù)染方法，主要包括氯化鉀負(fù)染法、氯化銅負(fù)染法、氯化鋅負(fù)染法、醋酸鹽負(fù)染法、氯化鎳負(fù)染法和鋅咪唑負(fù)染法[16-18]等，鋅咪唑負(fù)染是靈敏度最高的負(fù)染方法。鋅咪唑負(fù)染的機(jī)理如下：在染色過程中，鋅離子能與被 SDS（sodium dodecyl sulfate）包裹的蛋白質(zhì)相結(jié)合，而在凝膠表面剩余的鋅離子則會(huì)與咪唑形成沉淀，從而達(dá)到負(fù)染效果和檢測(cè)目的[19]。在鋅咪唑負(fù)染中，蛋白質(zhì)與鋅和咪唑的結(jié)合是可以逆轉(zhuǎn)的，洗脫后的蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)沒有改變，從而具有良好的質(zhì)譜兼容性，因此鋅咪唑負(fù)染法有望較好地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[20]。

圖 4 EZ-silver 雙重銀染法中染料促進(jìn)銀離子還原的推測(cè)機(jī)理

4 熒光法

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，凝膠上的蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)法正在逐漸成為研究的熱點(diǎn)。研究結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)法具有線性范圍廣、靈敏度高（1 ～ 100 ng/band）、質(zhì)譜兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，比較適合高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

尼羅紅是一種較早應(yīng)用于蛋白質(zhì)染色的熒光染料，它的檢測(cè)靈敏度為 20 ～ 100 ng/band，比考馬斯亮藍(lán)靈敏度稍高，且質(zhì)譜兼容性較好[21]。但尼羅紅熒光檢測(cè)法的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)為檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，在水溶液中尼羅紅易形成沉淀，且光穩(wěn)定性差，相對(duì)于其他商品化的蛋白質(zhì)熒光檢測(cè)試劑，其操作顯得比較困難。

最近 SYPRO 系列熒光染料被廣泛應(yīng)用于凝膠上蛋白質(zhì)的檢測(cè)，如 SYPRO Red、SYPRO Orange、SYPRO Tangerine 等，其操作簡(jiǎn)單，可在 30 ～ 60 min 內(nèi)完成染色操作，靈敏度達(dá)到 4 ～ 8 ng/band，同快速銀染或膠體考馬斯亮藍(lán)染色法靈敏度幾乎一致[22-24]。這三種熒光染料染色后的凝膠可置于紫外儀下，用 300 nm 激發(fā)光激發(fā)，拍照采集數(shù)據(jù)即可，同時(shí)還可以應(yīng)用 CCD-圖像分析工作站采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析。

SYPRO Ruby 是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的一種熒光染料，靈敏度較上述三種 SYPRO 系列染料高，介于考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法之間。且 SYPRO Ruby 有較廣的線性范圍和良好的質(zhì)譜兼容性，有時(shí)甚至可以檢測(cè)到銀染法所檢測(cè)不到的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SYPRO Ruby在檢測(cè)表皮角蛋白時(shí)靈敏度是酸性銀染法的 20 倍，是堿性銀染法的 8 倍[25]。SYPRO Ruby 染料結(jié)構(gòu)中含有螯合釕離子，使 SYPRO Ruby 上更多的磺酸基可以與質(zhì)子化的蛋白質(zhì)相結(jié)合，其靈敏度得到進(jìn)一步的提高[26]。

Mackintosh 等[27]在真菌中發(fā)現(xiàn)化合物 Epicocconone并將其應(yīng)用于凝膠上蛋白質(zhì)的熒光染色，其靈敏度比SYPRO Ruby 還高出數(shù)倍，Amersham Biosciences 公司將它開發(fā)成商品化的試劑盒，命名為 Deep Purple。Deep Purple熒光染色原理如下：Epicocconone 在溶液中本身不發(fā)熒光，其熒光產(chǎn)生主要是染料通過疏水性力與 SDS 包裹的蛋白質(zhì)上的賴氨酸作用，其熒光可得到極大增強(qiáng)[28]。

但由于 SYPRO Ruby 和 Deep Purple 等試劑盒價(jià)格昂貴，蛋白質(zhì)熒光染色方法的研究工作一直在不斷探索更加優(yōu)良易得的檢測(cè)方法。如 Cong 等[29]開發(fā)的 Palmatine 熒光染色法，靈敏度達(dá) 2 ～ 4 ng/band，并對(duì)原有的 BisANS 蛋白質(zhì)熒光染色法進(jìn)行改進(jìn)，將其靈敏度提高達(dá) 1 ～ 2 ng/band[30]。這兩種蛋白質(zhì)熒光染色方法染色成本較低，操作簡(jiǎn)單，靈敏度接近 SYPRO Ruby，可較好地應(yīng)用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

5 小結(jié)

綜上所述，目前圍繞染色方法的改進(jìn)主要集中在如何提高染色靈敏度，操作是否簡(jiǎn)捷，成本是否低廉及操作是否安全等方面。上述各類方法經(jīng)幾十年的發(fā)展雖都取得了一定的進(jìn)展，但還是存在許多不足之處有待于改進(jìn)。例如：①染料染色法雖操作簡(jiǎn)單，質(zhì)譜兼容性良好，但靈敏度還需提高；②銀染法仍然是目前最靈敏的染色方法，但其質(zhì)譜兼容性差和操作步驟繁瑣的問題有待改善；③熒光染色法靈敏度介于銀染和染料染色法之間，雖在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有較大的優(yōu)勢(shì)，但尋找更加穩(wěn)定、靈敏、安全的熒光染料，縮短操作時(shí)間仍是熒光染色法所需要解決的問題；④負(fù)染法可以較好地克服上述諸多缺點(diǎn)，但其主要缺點(diǎn)是對(duì)比度有待提高。以上幾點(diǎn)將成為未來幾年內(nèi)染色方法學(xué)需要解決的問題，這些方面問題的順利解決，將會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)染色方法的進(jìn)展產(chǎn)生重大影響。

[1] Fazekas de St Groth S, Webster RG, Datyner A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim Biophys Acta, 1963, 71:377-391.

[2] Meyer TS, Lambert BL. Coomassie brilliant blue R-250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochim Biophys Acta, 1965, 107(1):144-145.

[3] Bertolini MJ, Tankersley DL, Schroeder DD. Staining and destaining polyacrylamide gels: a comparison of coomassie blue and fast green protein dyes. Anal Biochem, 1976, 71(1):6-13.

[4] Crowle AJ, Cline LJ. An improved stain for immunodiffusion tests.J Immunol Methods, 1977, 17(3-4):379-381.

[5] Neuhoff V, Stamm R, Eibl H, et al. Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: A systematic analysis. Electrophoresis, 1985,6(9):427-448.

[6] Candiano G, Bruschi M, Musante L, et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.Electrophoresis, 2004, 25(9):1327-1333.

[7] Pink M, Verma N, Rettenmeier AW, et al. CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility. Electrophoreis,2010, 31(4):593-598.

[8] Choi JK, Tak KH, Jin LT, et al. Background-free, fast protein staining in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel using counterion dyes,zincon and ethyl violet. Electrophoresis, 2002, 23(24):4053-4059.

[9] Jin LT, Li XK, Cong WT, et al. Previsible silver staining of protein in electrophoresis gels with mass spectrometry compatibility. Anal Biochem, 2008, 383(2):137-143.

[10] Gorovsky MA, Carlson K, Rosenbaum JL. Simple methods for quantitive densitometry of polyacrylamide gels using fast green. Anal Biochem, 1970, 35(2):359-370.

[11] Hong HY, Choi JK, Yoo GS. Detection of proteins on polyacrylamide gels using calconcarboxylic acid. Anal Biochem, 1993, 214(2):96-99.

[12] Jin LT, Hwang SY, Yoo GS, et al. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gles using an azo dye,calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis, 2004,25(15):2494-2500.

[13] Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, et al. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem,1996, 68(5):850-858.

[14] Jin LT, Hwang SY, Yoo GS, et al. A mass spectrometry compatible silver staining method for protein incorporating a new silver sensitizer in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis gels.Proteomics, 2006, 6(8):2334-2337.

[15] Chevallet M, Luche S, Diemer H, et al. Sweet silver: a formaldehyde-free silver staining using aldoses as developing agents,with enhanced compatibility with mass spectrometry. Proteomics,2008, 8(23-24): 4853-4861.

[16] Lee C, Levin A, Branton D, et al. Copper staining: a five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1987, 166(2):308-312.

[17] Dzandu JK, Johnson JF, Wise GE. Sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis: staining of polypeptides using heavy metal salts. Anal Biochem, 1988, 174(1):157-167.

[18] Ortiz ML, Calero M, Fernandez Patron C, et al. Imidazole-SDS-Zn reverse staining of proteins in gels containing or not SDS and microsequence of individual unmodified electroblotted proteins.FEBS Lett, 1992, 296(2):300-304.

[19] Fernandez-Patron C, Castellanos-Serra L, Hardy E, et al. Understanding the mechanism of the zinc-ion stains of biomacromolecules in electrophoresis gels: generalization of the reverse-staining technique.Electrophoresis, 1998, 19(14):2398-2406.

[20] Castellanos-Serra L, Proenza W, Huerta V, et al. Proteome analysis of polyacrylamide gel-separated proteins visualized by reversible negative staining using imidazole-zinc salts. Electrophoresis, 1999,20(4-5):732-737.

[21] Daban JR, Bartolomé S, Samsó M. Use of the hydrophobic probe Nile red for the fluorescent staining of protein bands in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1991, 199(2):169-174.

[22] Steinberg TH, Jones LJ, Haugland RP, et al. SYPRO orange and SYPRO red protein gel stains: one-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal Biochem, 1996, 239(2):223-237.

[23] Steinberg TH, Haugland RP, Singer VL. Applications of SYPRO orange and SYPRO red protein gel stains. Anal Biochem, 1996,239(2):238-245.

[24] Steinberg TH, White HM, Singer VL. Optimal filter combinations for photographing SYPRO orange or SYPRO red dye-stained gels. Anal Biochem, 1997, 248(1):168-172.

[25] Berggren K, Chernokalskaya E, Steinberg TH, et al. Background-free,high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis, 2000, 21(12):2509-2521.

[26] Berggren KN, Schulenberg B, Lopez MF, et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics, 2002, 2(5):486-498.

[27] Mackintosh JA, Choi HY, Bae SH, et al. A fluorescent natural product for ultra sensitive detection of proteins in one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics, 2003, 3(12):2273-2288.

[28] Smejkal GB, Robinson MH, Lazarev A. Comparison of fluorescent stains: relative photostability and differential staining of proteins in two-dimensional gels. Electrophoresis, 2004, 25(15):2511-2519.

[29] Cong WT, Jin LT, Hwang SY, et al. Fast fluorescent staining of protein in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels by palmatine.Electrophoresis, 2008, 29(2):417-423.

[30] Cong WT, Hwang SY, Jin LT, et al. Improved conditions for fluorescent staining of proteins with 4, 4′-Dianilino-1, 1′- binaphthyl-5,5′-disulfonic acid in SDS-PAGE. Electrophoresis, 2008, 29(22):4487-4494.