RP-HPLC-MS分析漆葉中漆酚類化合物

晁 菲,邵 楊 ,魏朔南

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710069)

中國(guó)古書《后漢書·方技列傳》與《三國(guó)志》中均載有延年益壽之古方“漆葉青黏散”[1]。其中漆葉為漆樹(shù)科 (Anacardiaceae)漆屬 (Toxicodendron)植物漆樹(shù) (Toxicodendron vern icifera Stokes)的葉?！侗静菥V目》在喬木類漆項(xiàng)下記載其益精神、聰耳目,主治五尸勞疾、殺蟲(chóng)[2]。但時(shí)至今日,有關(guān)漆葉的藥用研究與應(yīng)用卻少有報(bào)道。僅李映麗[3]對(duì)漆葉的生藥學(xué)進(jìn)行了研究,并采用薄層層析法確定其含漆酚。有關(guān)漆酚的研究:Du[4]首次用 RP-HPLC法對(duì)生漆中未衍生化的漆酚進(jìn)行了分離;D raper[5]、Kim[6]及李林[7]等通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析指出,生漆中含有 C15和 C17的飽和、單烯、二烯及三烯等不同漆酚類化合物。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 HPLC分析技術(shù)建立了漆葉中漆酚類成分的分離方法,并結(jié)合液 -質(zhì)聯(lián)用技術(shù),利用其在中藥材成分定性方面的優(yōu)點(diǎn)對(duì)漆葉中的成分進(jìn)行了定性分析,為漆葉的臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器、試劑與材料

Agilent 1100系列高效液相色譜 -電噴霧 -離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀:包括 ESI離子源、SL型離子阱質(zhì)譜和 Chemistation 5.2工作站等;Waters 2965型高效液相色譜系統(tǒng):包括 2695型高壓恒流泵、2996 PDA檢測(cè)器和 Empower系統(tǒng)等;Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱;SENCOR系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵;KH-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器;TB-114型電子分析天平;Millipore超純水儀。

實(shí)驗(yàn)材料漆葉于 2009年 7月采自陜西平利縣。甲醇、乙腈為色譜純 (天津化學(xué)試劑廠),水為Millipore超純水,其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液制備

漆葉 10 g無(wú)水乙醇 30 m L浸泡 3次,合并濾液回收乙醇,所得物用氯仿 -水 (2∶1)萃取 3次,棄去水相,收集氯仿層并揮去溶劑即得浸膏。精密稱取該浸膏 0.01 g,甲醇溶解過(guò)濾,定容至 50 mL,過(guò)0.22μm濾膜,備用。

2.2 HPLC分析

2.2.1 流動(dòng)相及比例的確立

通過(guò)對(duì)甲醇 -水和乙腈 -水兩種體系進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn),使用甲醇 -水洗脫時(shí),分離效果不理想;而使用乙腈 -水洗脫時(shí)靈敏度較高,且主要色譜峰達(dá)到較好分離。進(jìn)一步對(duì)乙腈 -水的不同比例 85∶15、88∶12、91∶9、94∶6進(jìn)行優(yōu)化選擇 ,結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,當(dāng)流動(dòng)相的比例為 91∶9時(shí),各色譜峰分離度好、峰形窄、基線平穩(wěn)。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器 (PDA)對(duì)供試品進(jìn)行了全波段掃描,掃描波長(zhǎng)為 190～600 nm。結(jié)果表明,在 380 nm處檢測(cè)到的峰數(shù)目較多,且多數(shù)色譜峰的響應(yīng)值較大,故以 380 nm作為漆樹(shù)葉子提取物的 HPLC分析波長(zhǎng)。

2.2.3 流速及柱溫的選擇

通過(guò)對(duì) 0.3、0.6、0.8 mL·min-1等不同流速及25、30、35℃等不同柱溫進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):流速 0.6 mL·min-1、柱溫 35℃的色譜條件分離效果最佳。

2.2.4 色譜條件的確立

經(jīng)上述參數(shù)優(yōu)化后,確立色譜條件:流動(dòng)相為乙腈 -水 (91∶9 v/v);流速 0.6 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)380 nm;柱溫 35℃;進(jìn)樣量 20μL。漆樹(shù)葉子提取物的 HPLC分析見(jiàn)圖1。

圖1 樣品 HPLC分析譜圖

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液,按 2.2.4節(jié)方法重復(fù)進(jìn)樣 5次,測(cè)得 10個(gè)主要色譜峰峰面積積分值的 RSD均小于 3%,表明本法精密度良好。

2.2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一漆樹(shù)葉樣品 6份,按照 2.2.1節(jié)方法制成供試品溶液、2.2.4節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果 10個(gè)主要色譜峰峰面積的 RSD均小于 2%。

2.2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液 ,于 0、4、8、16、24、48 h分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算 10個(gè)主要色譜峰的 RSD均小于 3%,表明供試品溶液在 48 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3 HPLC-M S分析

2.3.1 分析條件

色譜條件同 2.2.4節(jié),之后 2∶1分流,1/3流出液進(jìn)入質(zhì)譜分析。其條件為:電噴霧離子化源負(fù)離子模式掃描;霧化氣為高純氮?dú)?、壓力?35.0 p si;干燥氣溫度為 350℃、流量為 8.0 L·m in-1;掃描質(zhì)量范圍為 100～1000 m/z。

2.3.2 測(cè)定結(jié)果

經(jīng) SL多級(jí)離子阱質(zhì)譜測(cè)定,漆酚類化合物在一級(jí)質(zhì)譜中大多以準(zhǔn)離子分子形式存在,很少有碎片離子,并且二級(jí)質(zhì)譜中碎片信息也較少,主要峰的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。通過(guò)分析各液相色譜峰與總離子流圖中所對(duì)應(yīng)離子峰的質(zhì)譜信息,并結(jié)合已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,可對(duì)液相所得各峰進(jìn)行歸屬 (見(jiàn)表1),定性鑒別出 9個(gè)漆酚類化合物,另 1個(gè)為未知物。

圖2 4個(gè)主要色譜峰的質(zhì)譜圖

表1 樣品質(zhì)譜分析結(jié)果

3 討 論

關(guān)于生漆和漆樹(shù)樹(shù)皮中漆酚的 HPLC分析研究已有較多報(bào)道[4-8]。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果,在對(duì)流動(dòng)相體系、波長(zhǎng)、流速及柱溫等條件進(jìn)行優(yōu)化選擇后,建立了漆葉中漆酚類化合物 HPLC分離的最佳條件:乙腈 -水 (91∶9 v/v)為流動(dòng)相、流速 0.6 mL·m in-1、波長(zhǎng) 380 nm、柱溫 35℃。該分析方法快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好,相比文獻(xiàn)[3]中所用薄層層析法,其結(jié)果更為精確。

液質(zhì)聯(lián)用分析顯示,化合物 1、2、4、8和 9為 C15類漆酚化合物,其中 1與 8為三烯漆酚;化合物 3、5、6和 7屬于 C17類漆酚化合物,其中 3、6和 7分子量相同,均為 C17三烯漆酚;但各個(gè)化合物在液相分析中所對(duì)應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間不同,且總離子流圖中信號(hào)也有差異;由此推斷 1與 8可能為同分異構(gòu)體,同時(shí) 3、6和 7之間也存在同分異構(gòu)現(xiàn)象,其具體結(jié)構(gòu)還有待確定。對(duì)于 m/z為 809.4的化合物 10,該分子量在以往相關(guān)文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道,有待進(jìn)一步鑒定。此外,漆葉中漆酚類化合物不僅存在單體,而且還有二聚體形式 (如化合物 1、8),這可能與漆酚在空氣或有氧環(huán)境中易被氧化聚合有關(guān)[9]。

中藥干漆具有祛瘀、破積、通經(jīng)、止痛、殺蟲(chóng)等功效[10],它經(jīng)生漆炮制而成,生漆的主要成分為漆酚。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11],生漆漆酚類化合物中主要為三烯漆酚,將漆酚尤其是三烯漆酚的含量檢測(cè)作為干漆藥材質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)具有重大意義[6]。本研究結(jié)果顯示,漆葉中三烯漆酚的相對(duì)峰面積占總峰面積的70%以上,表明漆葉與生漆中漆酚類化合物的組成與含量相似,即與干漆的入藥成分相近。同時(shí),漆葉入藥有主治五尸勞疾、殺蟲(chóng)之功效,與干漆也具相似之處。據(jù)此推測(cè),漆酚類化合物可能為漆葉具有藥效的主要成分之一。

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