甘薯葉片基因組DNA提取方法

黃艷嵐，張超凡

（湖南省作物研究所，湖南 長沙 410125）

許多植物組織中含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質，從這些組織中分離出的DNA由于多酚被氧化成棕色，多糖、單寧等物質與DNA結合形成粘稠的膠狀物，影響了DNA質量和純度，對隨后的酶切、PCR反應等有很強的抑制作用，因此在提取富含這類物質的基因組DNA時，應考慮去除多糖和酚類等物質。在提取甘薯葉片基因組DNA時也是如此，特別是在分子標記輔助育種、圖譜構建、基因定位、遺傳多樣性分析等領域，獲得高質量的DNA至關重要。目前已發(fā)表的用CTAB法和SDS法提取甘薯基因組DNA的方法[1-3]所提取的甘薯DNA質量不高，容易對后續(xù)的分子生物學實驗產(chǎn)生抑制作用。筆者針對甘薯葉片富含多糖、酚類等物質的特點，采用CTAB方法并加以改進，提取甘薯葉片基因組DNA，旨在為甘薯AFLP、Southern雜交等后續(xù)分子生物學研究工作提供高質量基因組DNA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試的32份甘薯品種來源于國家產(chǎn)業(yè)體系長沙甘薯試驗站實驗基地，具體名稱如表1所示。取1～32號甘薯頂部新鮮展開葉片3～4片，置已編號的保鮮袋中，冰上保存，隨后立即提取DNA。

1.1.2 試 劑 CTAB、Tris、EDTA、PVP、TEMED 購自北京鼎國公司；Taq酶購自天根生化公司；EcoRI、MseI和 T4 DNA連接酶購自 NEB公司；EcoRI和MseI連接接頭及引物均由北京奧科公司合成，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法 對照采用吳列洪[3]DNA提取方法（稱為方法A）和改進的方法（稱為方法B）。方法B為：取1 g新鮮葉片，加液氮研磨，轉入2 mL離心管，加入1 mL預熱的2×CTAB和150 mL無水乙醇，混勻，65℃水浴30～60 min，期間上下顛倒 2～3 次；加 0.6 倍體積氯仿：異戊醇（24∶1），混勻，12 000 rpm離心5 min；上清轉入新2 mL離心管，加0.6倍體積異丙醇，12 000 rpm離心5 min；沉淀用0.8 mL高鹽緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0，1 M NaCl） 充分融解，12 000 rpm離心5 min；上清加0.6倍體積異丙醇，12 000 rpm離心5 min；沉淀用400 μL超純水充分融解，加2.5倍體積無水乙醇，混勻，-20℃靜置30 min，12 000 rpm離心5 min；沉淀吹干，溶于200 μL超純水中。在2×CTAB提取緩沖液中加入一定量的無水乙醇和第一次異丙醇沉淀后用高鹽緩沖液充分融解沉淀，這是本方法的改進之處。

表1 研究所用的甘薯品種名稱

1.2.2 DNA樣品檢測 從32份甘薯DNA樣品中各取2 μL，進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的完整性。取4 μL DNA溶液用超純水稀釋至200 μL，用紫外分光光度計測定其在 230、260、280 nm處的紫外吸收光譜。將每個DNA樣品濃度稀釋成 50 μg/mL。

1.2.3 AFLP分析 參照張超凡[4]等方法進行。

2 結果與分析

2.1 甘薯葉片基因組DNA提取分析

提取32份甘薯葉片總DNA并進行電泳，由于各樣品用同一方法提取的DNA電泳效果無明顯差別。本文以4份樣品（處理1至處理4）的電泳圖為例，如圖1所示，其中A為用對照方法提取的甘薯DNA結果，B為用本方法提取的DNA結果。所有DNA樣品經(jīng)紫外分光光度計測定濃度、OD230、OD260、OD280，電泳圖中4份DNA樣品OD值結果如表2所示，方法B提取的DNA樣品OD260/OD230值>2.0，OD260/OD280值在 1.8～2.0 之間，DNA 樣品均為無色透明溶液。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果顯示，方法B提取的甘薯總DNA為一條清晰完整的帶，條帶沒有拖尾，說明本實驗提取的DNA純度高、質量好、相對分子量大，多糖和酚類等雜質去除得較充分。

表2 甘薯基因組DNA溶液的OD值

2.2 AFLP分析

經(jīng)過定量稀釋，32份甘薯葉片基因組DNA樣品濃度約為 50 μg/mL。取 100 ng樣品 DNA，經(jīng)EcoRI和MseI內(nèi)切酶進行酶切，T4-DNA連接酶連接，預擴后用E-ACA和M-CTG引物組合進行選擇性擴增。用對照方法提取的甘薯DNA經(jīng)酶切連接，預擴增產(chǎn)物電泳時沒有彌散的條帶，選擇性擴增就無法進行。圖2為用本方法提取的32份甘薯DNA-AFLP分析結果，如圖2所示，32份樣品DNA-AFLP條帶清晰，多態(tài)性好，說明本試驗采用的CTAB法提取的DNA質量好，可以滿足AFLP分析的要求。

3 討 論

提取植物DNA的方法很多，但每種方法中最為關鍵的有三部分。首先將DNA充分釋放到緩沖液中，其次是消除蛋白質、多糖、酚和色素等雜質的干擾，最后防止DNA的降解。其中，較難解決的是多糖類物質的去除。由于多糖的許多理化性質與核酸相似，因此不能用酚-氯仿抽提、選擇性沉淀等常規(guī)方法有效地去除多糖。由于甘薯是一種含多糖非常多的植物，因此甘薯基因組DNA提取的關鍵在于采用適當?shù)姆椒ㄈコ嗵堑却紊x物質的干擾。由于多糖可以抑制許多酶活性[5]，有多糖污染的DNA樣品純度較低，無法順利進行后續(xù)的分子生物學分析，如AFLP和Southern雜交。在本實驗中采用的方法A，由于提取的DNA含有大量多糖類物質，從外觀上看DNA溶液呈棕色，呈黏稠狀，用這樣的DNA樣品無法獲得AFLP的擴增結果。而利用方法B提取的甘薯DNA，充分考慮了在提取過程去除多糖，其中包括在CTAB提取液中加入一定量的無水乙醇和利用高鹽溶液溶解沉淀，這兩種改進都能降低DNA溶液中的多糖。Su等[6]在提取褐藻RNA時，單獨使用醋酸鉀去除多糖時無效，只有結合乙醇使用效果才明顯。Lopez-Gomez等[7]在提取芒果中果皮的RNA時，在勻漿液中加入0.25倍體積無水乙醇和0.11倍體積的5 mol/L醋酸鉀溶液，以去除多糖雜質。譚孟君等在提取水稻基因組DNA時利用高鹽溶液溶解沉淀能夠獲得高質量的DNA用于SSR分子標記[8]。本文采用的方法與其他提取甘薯基因組的方法相比不需要用到β-巰基乙醇，能減少實驗過程中對實驗者的傷害，能穩(wěn)定高效獲得高質量的基因組DNA。

[1]李 強，揭 琴，劉慶昌，等.甘薯基因組DNA高效快速提取方法[J].分子植物育種，2007，5（5）：743-746.

[2]張換樣，李 靜，南芝潤，等.甘薯DNA的小量快速提取[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2009，37（1）：12-14.

[3]吳列洪，謝德平，張燕春，等.微量法快速提取甘薯葉DNA條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（31）：15157-15159.

[4]張超凡，黃艷嵐，周 虹，等.湖南甘薯品種AFLP標記的遺傳差異分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（4）：706-710.

[5]Fang G，Hammar S，Grumet R.A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J].Biofeedback，1992，13（1）：52-54.

[6]Su X，Gibor A.A method for RNA isolation from marine macroalgae[J].Anal Biochem，1988，174：650-657.

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[8]譚孟君，肖層林，詹慶才.利用SSR分子標記鑒定雜交稻種子金優(yōu) 299 純度研究[J].作物研究，2008，（2）：73-75.