透明質(zhì)酸鈉對大鼠成肌細胞體外成骨分化的影響

張玉強，李游，王巖峰，王偉，呂剛

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽 110004；3.錦州市中心醫(yī)院骨科，遼寧錦州 121001；4.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧 錦州 121001）

透明質(zhì)酸鈉對大鼠成肌細胞體外成骨分化的影響

張玉強1，李游2，王巖峰1，王偉3，呂剛4

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽 110004；3.錦州市中心醫(yī)院骨科，遼寧錦州 121001；4.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧 錦州 121001）

目的研究透明質(zhì)酸鈉對成肌細胞體外成骨誘導(dǎo)分化的影響。方法 運用差速貼壁法和（或）酶消化法分離純化的大鼠成肌細胞，將培養(yǎng)至第3代的細胞分為：（1）實驗組：采用含0.1%的透明質(zhì)酸鈉和500ng/mL的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；（2）對照組：以含500ng/mL rhBMP-2的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。觀察誘導(dǎo)過程中成肌細胞形態(tài)變化。第3周時對其進行成骨指標檢測（堿性磷酸酶活性，I型膠原免疫組化，茜素紅和堿性磷酸酶的鈣結(jié)節(jié)染色）。結(jié)果 實驗組和對照組成肌細胞在誘導(dǎo)過程中形態(tài)學(xué)改變相似。實驗組和對照組堿性磷酸酶活性均升高，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，I型膠原免疫組化均呈陽性，茜素紅和堿性磷酸酶染色均可見大量鈣結(jié)節(jié)。結(jié)論透明質(zhì)酸鈉不抑制成肌細胞體外成骨分化，與成肌細胞具有良好的生物相容性。

透明質(zhì)酸鈉；成肌細胞；骨形態(tài)發(fā)生蛋白

研究證實，透明質(zhì)酸鈉與成肌細胞具有良好的生物相容性［1～8］，對體外培養(yǎng)成肌細胞無明顯影響，是成肌細胞良好的載體材料［5，6］。也有研究認為，透明質(zhì)酸鈉在促進成肌細胞增殖時，抑制成肌細胞分化融合為肌小管［1，3］。透明質(zhì)酸鈉是否抑制成肌細胞向成骨前體細胞方向分化目前尚不清楚。本研究擬在成肌細胞誘導(dǎo)分化為成骨前體細胞過程中加入透明質(zhì)酸鈉，觀察其是否影響成肌細胞的體外成骨誘導(dǎo)分化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：新生1周的SD大鼠［由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（遼）2003-0007］，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標準。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季清生物工程材料有限公司），Dispase、CollagenaseⅡ、L-谷氨酰胺、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（recombination of human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2） （Sigma 公 司 ），Desmin抗體、Ⅰ型膠原抗體（博士德生物工程有限公司），茜素紅（北京拜爾笛生物工程有限公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染液（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離、培養(yǎng)及純化：取大鼠下肢骨骼肌1cm×1cm×1cm，參照文獻［9，10］的方法，采用混合酶消化分離成肌細胞，差速貼壁法進行純化。將純化的成肌細胞接種于培養(yǎng)瓶，置37℃，5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。常規(guī)換液，傳代至第3代備用。

1.2.2 細胞鑒定：將成肌細胞接種于置有消毒蓋玻片的6孔板內(nèi)，待細胞于蓋玻片上貼壁達70%～80%，按免疫組化步驟進行Desmin染色，胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性，以PBS為一抗作陰性對照。

1.2.3 透明質(zhì)酸鈉對成肌細胞成骨分化的影響：將上述第3代成肌細胞接種于置有消毒蓋玻片的12孔板內(nèi)，待細胞融合達70%～80%時，進行成骨誘導(dǎo)。將細胞隨機分為：（1）實驗組：加入含0.1%透明質(zhì)酸鈉和500ng/mL rhBMP-2的培養(yǎng)基（82%高糖DMEM+15%胎牛血清+2%雙抗+1%L-谷氨酰胺）；（2）對照組：加入含500ng/mL rhBMP-2的培養(yǎng)基。隔日換液，觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。參照文獻［9］的結(jié)果，在第3周時對其進行成骨鑒定，包括應(yīng)用酶標儀對2組誘導(dǎo)細胞進行堿性磷酸酶活性測定，Ⅰ型膠原免疫組化染色，茜素紅和堿性磷酸酶染色。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)的成肌細胞呈梭形，至培養(yǎng)的第5～7日，相鄰細胞開始彼此融合，并逐漸形成肌管，繼續(xù)培養(yǎng)，可觀察到有節(jié)律收縮的肌管。Desmin的細胞免疫組織化學(xué)染色呈陽性，胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕黃色顆粒，胞核藍染。見圖1，2。

2.2 透明質(zhì)酸鈉對成肌細胞成骨分化的影響

2.2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察：在培養(yǎng)的前7d，胞質(zhì)均無明顯變化，但實驗組可見少量相鄰細胞融合，對照組相互融合細胞明顯增多；第14天時，2組細胞的胞質(zhì)內(nèi)可見少量折光性物質(zhì)，實驗組相鄰細胞融合較對照組少；第21天時，2組細胞胞質(zhì)內(nèi)均可見大量折光性物質(zhì)，對照組相鄰細胞融合較實驗組多。提示含0.1%透明質(zhì)酸鈉的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組細胞融合率低于單純誘導(dǎo)培養(yǎng)基組。見圖3。

2.2.2 成骨鑒定結(jié)果：（1）ALP活性測定：結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時間的延長，2組細胞表達ALP的活性均增強，但對照組與實驗組總體平均值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

（2）Ⅰ型膠原的免疫組化：對rhBMP-2誘導(dǎo)3周的成肌細胞行Ⅰ型膠原免疫細胞化學(xué)染色，見2組細胞胞質(zhì)中均出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀，表明Ⅰ型膠原染色呈陽性，見圖4。

表1實驗組和對照組在不同時間點的A L P值（U/L，±s）T a b.1T h e r e s u l t s o f A L Pa t d i f f e r e n t p o i n t s i n e x p e r i me n t a l a n d c o n t r o l g r o u p s（U/L，±s）Group 3d 6d 9d 12d 14d Experimental group 10.56±0.87 13.83±0.54 17.15±0.63 19.38±0.85 20.46±0.88Control group 11.50±1.90 14.13±0.29 17.26±0.74 19.53±0.38 20.68±0.68ALP，alkaline phosphatase.

（3）茜素紅染色：應(yīng)用茜素紅S對rhBMP-2誘導(dǎo)3周的2組成肌細胞染色，均可見胞質(zhì)內(nèi)形成大量紅色沉淀，表明胞質(zhì)內(nèi)均有鈣結(jié)節(jié)形成，見圖5。

（4）ALP染色：應(yīng)用ALP試劑盒對rhBMP-2誘導(dǎo)3周的細胞進行染色，可見胞質(zhì)中有大量黑色顆粒，實驗組與對照組無明顯差異，見圖6。

3 討論

透明質(zhì)酸鈉作為一種生物活性物質(zhì)，具有高度黏彈性、可塑性、滲透性、獨特的流變學(xué)特性以及良好的生物相容性。研究顯示，透明質(zhì)酸鈉對成肌細胞的增殖和分化均有影響。Kujawa等［1］發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸鈉可促進成肌細胞增殖，同時抑制體外培養(yǎng)的成肌細胞融合形成肌管。Yoshimura等［2］認為透明質(zhì)酸鈉的抑制作用可逆，去除外源性透明質(zhì)酸鈉后融合功能恢復(fù)。張斌等［3，4］證實透明質(zhì)酸鈉能加速成肌細胞增殖，使細胞較早進入對數(shù)增殖期，倍增和峰值出現(xiàn)時間均顯著提前，細胞增殖幅度加大，衰退現(xiàn)象減緩。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入了含透明質(zhì)酸鈉與rhBMP-2的實驗組與僅加入rhBMP-2的對照組中成肌細胞均有融合，但實驗組較對照組細胞融合少。rhBMP-2屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族，具有很強的細胞黏附能力。我們推測，實驗組和對照組肌管形成差異的原因可能是對照組中加入的外源性rhBMP-2促進了成肌細胞聚集，導(dǎo)致肌管形成較多，而實驗組加入的rhBMP-2可能削弱了透明質(zhì)酸鈉對成肌細胞融合的抑制作用。

目前，將透明質(zhì)酸鈉用于誘導(dǎo)細胞成骨的實驗研究很多且效果顯著。林在俊等［7］在研究透明質(zhì)酸鈉對rhBMP-2轉(zhuǎn)染的羊骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖、分化的影響時發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸鈉與BMSCs具有較好的相容性，一定濃度的透明質(zhì)酸鈉能促進BMSCs的增殖，對BMSCs向成骨細胞的分化也有一定的促進作用。另外，Crouzier等［8］在將透明質(zhì)酸鈉與 rhBMP-2用于誘導(dǎo)C2C12成肌細胞向成骨細胞分化的研究中發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸鈉可延長rhBMP-2的生物學(xué)活性。本研究將0.1%的透明質(zhì)酸鈉加入含rhBMP-2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成肌細胞，觀察到有大量鈣結(jié)節(jié)形成，表明透明質(zhì)酸鈉并不抑制成肌細胞向成骨方向分化。Kawan等［11］研究證實，透明質(zhì)酸鈉通過阻斷rhBMP-2受體拮抗物分泌型多肽頭蛋白和卵泡抑素表達，抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）磷酸化，促進人成骨肉瘤細胞MG63的成骨分化。本研究觀察到透明質(zhì)酸鈉可促進成肌細胞的成骨分化，其機制可能是透明質(zhì)酸鈉與rhBMP-2發(fā)揮協(xié)同作用促進了成肌細胞的成骨分化，而堿性磷酸酶活性檢測、Ⅰ型膠原的免疫組化、茜素紅染色、堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示對照組和實驗組無顯著差異，其原因可能與本研究未采用蛋白印跡、聚合酶鏈式反應(yīng)和熒光定量等更靈敏的檢測方法有關(guān)。

綜上所述，一定濃度的透明質(zhì)酸鈉并不抑制體外培養(yǎng)的成肌細胞向成骨細胞方向分化，透明質(zhì)酸鈉與成肌細胞具有良好的生物相容性，可作為成肌細胞培養(yǎng)的理想載體。

［1］Kujawa MJ，Pechak DG，F(xiàn)iszman MY，et a1.Hyaluronic acid bonded to cell culture surfaces inhibits the program of myogenesis ［J］.Dev Biol，1986，113（1）：10-16.

［2］Yoshimura M.Change of hyaluronic acid synthesis during differentiation of myogenic cells and its relation to transformation of myoblasts by Rous sarcoma virus［J］.Cell Differ，1985，16（3）：175-185.

［3］張斌，黃富國，解慧琪，等.透明質(zhì)酸鈉對大鼠成肌細胞增殖和分化的影響［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2006，20（7）：747-750.

［4］黃富國，張斌，楊志明.改良載體提高大鼠成肌細胞移植效率［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10（25）：34-36.

［5］Wang W，F(xiàn)an M，Zhang L，et al.Compatibility of hyaluronic acid hydrogel and skeletal muscle myoblasts ［J］.Biomed Mater，2009，4（2）：025011.

［6］王偉，范明，張力，等.透明質(zhì)酸凝膠在成肌細胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］.解剖科學(xué)進展，2007，13（3）：215-218.

［7］林在俊，朱振安，孟凡琳，等.透明質(zhì)酸對BMP-2轉(zhuǎn)染的羊BMSCs增殖、分化的影響［J］.臨床骨科雜志，2007，10（4）：344-347.

［8］Crouzier T，Szarpak A，Boudou T，et al.Polysaccharide-blend multilayers containing hyaluronan and heparin as a delivery system for rhBMP-2［J］.Small，2010，6（5）：651-662.

［9］張玉強，王偉，范明，等.體外誘導(dǎo)大鼠成肌細胞轉(zhuǎn)化為成骨前體細胞的實驗研究［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2009，33（1）：14-17.

［10］張力，范明，王偉，等.改良法體外培養(yǎng)大鼠成肌細胞的實驗研究［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2007，31（1）：62-65.

［11］Kawano M，Ariyoshi W，Iwanaga K，et al.Mechanism involved in enhancement of osteoblast differentiation by hyaluronic acid［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，405（4）：575-580.

（編輯王又冬，英文編輯劉寶林）

Effect of Sodium Hyaluronate on In Vitro Osteoplastic Differentiation of Rat’s Myoblasts

ZHANG Yu-qiang1，LI You2，WANG Yan-feng1，WANG Wei3，L譈 Gang4
（1.Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Ophthalmology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Orthopedics，Central Hospital of Jinzhou，Jinzhou 121001，China；4.Department of Orthopedics，The First Affiliated Hospital，Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of sodium hyaluronate solution on the osteoplastic differentiation of rat’s myoblasts.MethodsThe minced muscles were digested with mixed digestive juices，followed by the isolation，culture and purification of the myoblasts.The third subculture myoblasts were cultured in two growth media，in which experimental group containing 0.1%sodium hyaluronate and 500ng/mL rhBMP-2，the control group containing 500ng/mL rhBMP-2，respectively.The morphological change of induced myoblasts in each medium was observed carefully.Three weeks later，a series of examination were performed，including：ALP activity，typeⅠcollagen immunohistochemistry，and new calcifying nodules staining with Alizarin red S and ALP.ResultsThe morphological change in each medium was similar during the induced process.There was a difference between the two groups on ALP activity，but the ALP activity increased and there was no statistic difference（P>0.05）.The immunohistochemistry of typeⅠcollagen was positive，a great quantity of new calcifying nodules was seen by the staining of Alizarin red S and ALP.ConclusionSodium hyaluronate could not inhibit the osteoplastic differentiation of rat’s myoblasts in vitro，it could be a proper media for myoblasts.

sodium hyaluronate；myoblasts；bone morphogenetic protein

R318.08

A

0258-4646（2011）05-0408-04

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1816.030

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.030.html

張玉強（1981-），男，博士研究生.

呂剛，E-mail：lvgang@lnmu.edu.cn

2010-11-29

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2011-05-1815：25

·短篇論著·