液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王宇歆，劉洪斌，李東華

中藥研究手段的現(xiàn)代化是中藥現(xiàn)代化最重要的組成部分，其中包括用現(xiàn)代科技手段對(duì)中藥有效成分確定，中藥的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，以及中藥代謝過(guò)程確定等一系列的問(wèn)題。其中高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(high performance liquid chromatograph-mass spectrometer，HPLC-MS)將色譜的分離能力與高分辨光譜的表征能力相結(jié)合，不僅具有色譜的高效、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、操作方便、使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有定性、定量能力強(qiáng)的特點(diǎn)，非常適合活性成分復(fù)雜、含量低的植物藥研究，為中藥中有效成分的定性、定量及中藥代謝等問(wèn)題的解決提供了強(qiáng)有力的工具和手段[1]。

1 質(zhì)譜技術(shù)簡(jiǎn)介

質(zhì)譜儀器一般由真空系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器和計(jì)算機(jī)控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成[2]，質(zhì)譜儀需要在高真空下工作:⑴大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲；⑵用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起放電；⑶引起額外的離子-分子反應(yīng)，改變裂解模型，譜圖復(fù)雜化。

目前常用的高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用具有兩大分類(lèi)系統(tǒng)，一種是從質(zhì)譜的離子源角度來(lái)劃分，包括電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)、大氣壓光電離源(atmosphere pressure Interface，APPI)和基質(zhì)輔助激光解析電離源(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)等[3]；另一種是從質(zhì)譜的質(zhì)量分析器角度來(lái)劃分，包括四極桿、離子阱、飛行時(shí)間(Time-of-Flight，TOF)和傅立葉變換質(zhì)譜等[4]。

從離子源角度來(lái)看，ESI適合于中高極性的化合物，特別適合于反相液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，是目前液質(zhì)聯(lián)用中應(yīng)用最廣泛的一種離子化方式，ESI-MS的優(yōu)點(diǎn)還在于它是一種濃度型檢測(cè)器，因此可以不受樣品量的限制，近幾年發(fā)展起來(lái)的微噴霧和納噴霧技術(shù)尤其適合微量樣品的高靈敏度分析[5]。APCI采用電暈放電來(lái)電離氣相的分析物，因此要求被分析物具有一定的揮發(fā)性，它最適合于中、低極性的中等分子量化合物，不易形成多電荷，譜圖解析相對(duì)簡(jiǎn)單[6]。APPI是在大氣壓下利用光化作用將氣相的被分析物離子化的技術(shù)，其適應(yīng)范圍與APCI相似，是對(duì)APCI的補(bǔ)充[3]。MALDI則是將樣品加入到一種能夠強(qiáng)烈吸收入射激光的基質(zhì)中，通過(guò)能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生樣品的分子離子或準(zhǔn)分子離子，其優(yōu)點(diǎn)在于容易與TOF聯(lián)用測(cè)定高質(zhì)量數(shù)的分子，其靈敏度高，樣品制備較簡(jiǎn)單，現(xiàn)己被廣泛應(yīng)于分析蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、核苷酸、多糖以及合成聚合物等。但由于MALDI自身的特點(diǎn)，目前直接在線與HPLC聯(lián)用的應(yīng)用研究還相對(duì)較少[7]。

從質(zhì)量分析器角度來(lái)看，四極桿是在交變電場(chǎng)的作用下，使某些符合要求的離子通過(guò)四極桿到達(dá)檢測(cè)器，三級(jí)四極桿質(zhì)譜則可以實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜功能[8]。離子阱則是首先把離子聚集到阱內(nèi)，通過(guò)改變電參數(shù)把阱內(nèi)離子逐個(gè)釋放到達(dá)檢測(cè)器，離子阱質(zhì)譜具有多級(jí)質(zhì)譜功能，對(duì)于解析化合物結(jié)構(gòu)更為有利，但是質(zhì)量準(zhǔn)確度和分辨率不及四極桿質(zhì)量分析器。對(duì)于一級(jí)質(zhì)譜選擇離子檢測(cè)或串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)，四極桿質(zhì)量分析器的靈敏度一般比離子阱高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，因此更適用于微量或痕量成分的定量分析[9]。飛行時(shí)間質(zhì)譜是應(yīng)用不同m/z離子的飛行速度不同，離子飛行通過(guò)相同的路徑到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間不同而獲得質(zhì)量分離，它常與MALDI聯(lián)用，優(yōu)點(diǎn)是掃描速度快、分析的質(zhì)量范圍寬，質(zhì)量測(cè)定精確[10]。

2 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥研究進(jìn)展

2.1 中藥成分分析 隨著人們對(duì)藥用植物成分的廣泛深入的研究，對(duì)已知化合物的研究，在有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可利用液質(zhì)聯(lián)用，將樣品組分的保留時(shí)間、分子量信息與標(biāo)準(zhǔn)品相比較，從而快速鑒定已知化學(xué)成分；在無(wú)現(xiàn)成標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可以根據(jù)樣品組分的分子量信息，特別是由串聯(lián)質(zhì)譜得到的特征碎片離子或中性丟失等結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，從而進(jìn)行快速鑒定[11]。例如，Li等[12]利用液質(zhì)聯(lián)用，通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、質(zhì)譜分子量信息等對(duì)黃柏皮層中10種化學(xué)成分進(jìn)行了快速鑒定。Zhang等[13]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)白芷提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析，在30min內(nèi)初步鑒定了23種呋喃駢香豆精。

液質(zhì)聯(lián)用不僅可以快速鑒定中藥中的已知化學(xué)成分，而且能快速鑒定未知化學(xué)成分。由于中藥提取物中的同類(lèi)化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)很相似，因此可以對(duì)數(shù)個(gè)已知單體化合物進(jìn)行質(zhì)譜裂解分析，研究這一類(lèi)化合物的裂解特征以及結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異引起的裂解行為的不同，總結(jié)出基于結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，然后利用這個(gè)規(guī)律，根據(jù)這類(lèi)化合物未知成分的質(zhì)譜裂解特征直接推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)[14]。例如，Petsalo等[15]利用類(lèi)黃酮化合物在負(fù)離子模式下，糖苷取代基位置的不同引起質(zhì)譜碎裂產(chǎn)生的糖苷配基奇電子離子的相對(duì)豐度不同的規(guī)律，對(duì)紅景天提取物進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，直接快速鑒定了其中的15種化合物，其中10個(gè)含量較少的化合物為首次從該植物中報(bào)道。Grayer等[16]從9種羅勒屬植物中檢測(cè)到了23種黃酮類(lèi)化合物。其中15種組分通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時(shí)間以及質(zhì)譜分子量信息得到直接確定，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律確定了1種新化學(xué)物。

因此，液質(zhì)聯(lián)用可以快速鑒定中藥的已知或未知化學(xué)成分，對(duì)已知化合物，可以避免重復(fù)工作，對(duì)未知化合物，特別是其中感興趣的微量活性成分，可以進(jìn)行靶裂解，從而有效地指導(dǎo)選擇性分離提取實(shí)驗(yàn)，加快發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的分析速度。

2.2 中藥質(zhì)量控制 目前，現(xiàn)行的中藥質(zhì)量控制方法主要是對(duì)一些有效成分或特征性成分進(jìn)行定性及定量分析，然而中藥特有的多成分、多靶點(diǎn)作用模式?jīng)Q定了其藥效并非是某幾個(gè)“指標(biāo)成分”或“主要成分”在起作用，而是多種成分共同作用的結(jié)果。中藥指紋圖譜分析是對(duì)中藥及其制劑進(jìn)行綜合宏觀分析的可行手段，能夠全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量[11]。目前，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局要求制造商對(duì)中藥注射液及其原料應(yīng)用指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)控。這也促進(jìn)了HPLC-MS技術(shù)在中藥質(zhì)控方面的發(fā)展。

HPLC-MS技術(shù)與常用的液相-紫外技術(shù)相比，可以提供色譜峰相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息，根據(jù)斷裂的片段以及文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢(shì)。

Song等[17]利用HPLC-MSn技術(shù)，建立了銀杏葉提取物的多維指紋圖譜，可同時(shí)得到各個(gè)成分的保留時(shí)間、線紫外光譜圖、一級(jí)質(zhì)譜圖(各個(gè)成分的相對(duì)分子質(zhì)量)和二級(jí)質(zhì)譜圖(某成分的特征碎片)，使同時(shí)檢測(cè)銀杏葉中兩類(lèi)有效成分——黃酮和內(nèi)酯類(lèi)化合物成為可能。研究采用電噴霧離子源，負(fù)離子檢測(cè)模式下，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，考察了15個(gè)產(chǎn)地的銀杏葉提取物與正宗銀杏提取物的相似度。HPLC-MS用于質(zhì)量控制的研究，不僅僅是在指紋圖譜中應(yīng)用，最有意義的是對(duì)中藥材、天然藥材及成藥中含量低，沒(méi)有紫外吸收線或紫外響應(yīng)值低的化合物，尤其是毒性成分進(jìn)行含量測(cè)定。HPLC-MS技術(shù)分析樣品不需要進(jìn)行繁瑣和復(fù)雜的前處理，同時(shí)得到化合物的保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量及特征結(jié)構(gòu)碎片等豐富的信息，具有高效快速和高靈敏度的特點(diǎn)，尤其適用于含量少、無(wú)特征紫外吸收官能團(tuán)的分析檢測(cè)。

2.3 中藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析 藥物代謝過(guò)程包括藥物分子在生物系統(tǒng)中的吸收、分布、代謝及排泄，這些因素決定了藥物能否以適當(dāng)濃度到達(dá)目標(biāo)部位，并停留一定時(shí)間，從而使藥物的療效得以發(fā)揮。HPLC-MS在藥物代謝研究中除了可確定分子量之外，還可以根據(jù)特異性斷裂規(guī)律推導(dǎo)出重要部分結(jié)構(gòu)甚至是完整的結(jié)構(gòu)。其根據(jù)是由于多數(shù)藥物的代謝物保留了原形藥物分子的骨架結(jié)構(gòu)，因此，代謝物可能與母體藥物具有相似的裂解規(guī)律，即失去一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征離子，利用HPLC-MS可以迅速找到可能的代謝物，并鑒定出結(jié)構(gòu)。

Cheng等人[18]對(duì)最常用中草藥甘草進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，應(yīng)用HPLC-MS確定了大鼠口服臨床劑量甘草代謝物中42種血漿代謝物和62種尿代謝物，這是完全依照臨床劑量進(jìn)行的中草藥代謝組學(xué)研究。目前,應(yīng)用LC-MS進(jìn)行快速高通量的代謝組學(xué)研究已成為中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究的熱點(diǎn)。Xin等[19]成功建立了HPLC-MS快速測(cè)定浙貝母灌胃后大鼠血漿中貝母素、貝母酮和異貝母堿含量的方法，用于中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究，此方法在0.505～96.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.999）。對(duì)于復(fù)方的代謝組學(xué)研究也是LC-MS的研究趨勢(shì)。Su等[20]報(bào)道應(yīng)用UPLC-MS鑒定了口服少腹逐瘀湯大鼠的血漿，共鑒定16個(gè)峰，其中12個(gè)峰與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了對(duì)照，另外通過(guò)據(jù)斷裂的片段以及文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)了9種代謝物。

3 展望

中醫(yī)藥學(xué)是祖國(guó)醫(yī)學(xué)幾千年臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，是我國(guó)醫(yī)學(xué)的瑰寶，但是中藥活性成分復(fù)雜、代謝物在生物樣品中濃度較低，且生物樣品內(nèi)源性雜質(zhì)較多，給中藥研究帶來(lái)了相當(dāng)大的困難。利用HPLC-MS等現(xiàn)代的分析手段是中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的必然要求。HPLC-MS技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速篩選、中藥材鑒別、質(zhì)量控制、代謝機(jī)理和動(dòng)力學(xué)以及配伍規(guī)律研究等領(lǐng)域。HPLC-MS技術(shù)具有的高分離、高靈敏度、高選擇性以及能提供豐富結(jié)構(gòu)信息等一系列優(yōu)點(diǎn)，可有效地對(duì)中藥成分進(jìn)行整體分析。因此HPLC-MS再加上氣相色譜法-質(zhì)譜和高效液相色譜-核磁譜等聯(lián)用技術(shù)的補(bǔ)充，將會(huì)使中醫(yī)藥學(xué)研究上升到更高水平。

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