沙蔥多糖除蛋白方法的研究

段偉偉 張興夫 敖長金

沙蔥（Allium mongolicum Regel）屬被子植物門（Angiospermae），百合科（Liliaceae），蔥屬（Allium），學(xué)名蒙古韭，蒙古語稱為“特那”，是一種生命力頑強(qiáng)的植物[1]。沙蔥主要分布于新疆、青海、甘肅、寧夏、陜西、內(nèi)蒙古、遼寧、蒙古西南部等地的荒漠草原和沙地[2]，其特點(diǎn)是抗寒、抗旱，適應(yīng)能力強(qiáng)。多糖是一類天然高分子化合物，它由10個(gè)以上乃至幾千個(gè)單糖以糖苷鍵相連形成的線型或支鏈的高聚物，一般多糖常由100個(gè)以上甚至幾千個(gè)單糖基組成[3]。近幾十年來，由于分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到了多糖及其復(fù)合物分子具有極其重要的生物功能，它在免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識(shí)別和細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)确矫娑及l(fā)揮著巨大的作用[4-7]。由于沙蔥多糖溶液中含有大量的蛋白質(zhì)，這會(huì)對沙蔥多糖的進(jìn)一步分離和純化造成影響，所以試驗(yàn)研究了Sevage法和三氯乙酸法去除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，并對這兩種方法進(jìn)行了比較，為沙蔥多糖的進(jìn)一步分離純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

沙蔥采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗天然草場；無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、三氯乙酸、苯酚，均為分析純，購于北京化工廠；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250購于呼和浩特市博奧試劑公司。

Sartorious BP221S電子天平；Unic2100可見分光光度計(jì)；SK-1型快速混勻器；低速大容量多管離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙蔥多糖提取

將烘干后沙蔥用98%的工業(yè)酒精按1∶8的比例（烘干沙蔥∶酒精）70℃脫脂1次，65℃烘干后按25∶1的水料比，80℃浸提8 h，抽濾棄去殘?jiān)蟮亩嗵翘崛∫航?jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/3，加等體積無水乙醇于4℃過夜，6 000 r/min離心30 min得沙蔥粗多糖，冷凍干燥后稱重，用蒸餾水配置成10 mg/ml沙蔥粗多糖溶液待用。

1.2.2 多糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法[8]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取105℃下干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0.395 g于250 ml容量瓶中，加水至刻度，配得濃度為1.58 mg/ml葡萄糖母液，用移液管移取10 ml葡萄糖母液至100 ml容量瓶中定容至刻度，即得濃度為0.158 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

苯酚溶液的配制:稱取苯酚100.000 g，加0.1 g鋁片和0.05 g NaHCO3進(jìn)行常壓蒸餾，收集（180±20）℃的餾分。精密稱取該餾分6.000 g充分溶解于94.000 g去離子水中，轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，即得6%苯酚溶液，將其置于冰箱中備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別吸取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 ml，各以去離子水補(bǔ)至1.5 ml。之后加入6%苯酚溶液2.0 ml及濃硫酸6.5 ml，靜置10 min，搖勻，置于40℃恒溫水浴鍋中30 min，取出后冷卻10 min后于490 nm測定溶液吸光值，以1.5 ml蒸餾水按照同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖溶液的濃度，縱坐標(biāo)為光密度值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[9]。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：準(zhǔn)確稱取100 mg牛血清蛋白，溶于100 ml蒸餾水中，配置為1 mg/ml的原液。

考馬斯亮藍(lán)G-250的配置：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 ml、90%的乙醇當(dāng)中，加入85%的H3PO4100 ml,最后用蒸餾水定容到1 000 ml。

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取牛血清蛋白原液20、40、60、80、100 μl，各以去離子水補(bǔ)置1 ml。分別加入5 ml配置好的考馬斯亮藍(lán)G-250。搖勻后靜置2 min在595 nm下比色，記錄下OD值。

1.2.4 Sevage法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)

采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇試劑添加量（A）、氯仿與正丁醇比（B）、振搖時(shí)間（C）3個(gè)因素。優(yōu)化Sevage法除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)

1.2.5 三氯乙酸法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)

高濃度的三氯乙酸會(huì)造成多糖溶液的大量損失，一般用于除蛋白的三氯乙酸濃度都在5%～30%，考慮到沙蔥多糖的提取率不是很高，試驗(yàn)把三氯乙酸的用量范圍設(shè)定在5%～15%，通過正交試驗(yàn)研究三氯乙酸除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)。采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇三氯乙酸的濃度（A）、三氯乙酸添加量（B）、振搖時(shí)間（C）3個(gè)因素。正交試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示:葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=8.834 2x-0.061 5，R2=0.999 8。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 蛋白質(zhì)含量測定

蛋白曲線的線性回歸方程為：y=0.007x-0.047，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

Sevage法除蛋白正交試驗(yàn)以除蛋白率（K）和多糖損失率(T)為評價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)的目的是找出除蛋白率最大而多糖損失率最小的工藝參數(shù)組合，綜合考慮這兩個(gè)因素，保證在多糖損失率最小的條件下除蛋白率最大。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 Sevage法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)結(jié)果（見表3）

表3 Sevage法除蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3的極差分析結(jié)果可知：影響Sevage法除沙蔥多糖溶液中蛋白效果的主次因素為B(氯仿與正丁醇的比例)＞C(振搖時(shí)間)＞A(試劑添加量)，最佳的工藝組合條件為A2B2C2，即Sevage試劑添加量為沙蔥多糖溶液體積的1/4，氯仿與正丁醇的比例為3∶1，振搖時(shí)間為25 min。影響多糖損失率的因素的主次程度為C(振搖時(shí)間)＞A(試劑添加量)＞B(氯仿與正丁醇比例)，多糖損失率最小的工藝組合為A2B2C3，即Sevage試劑添加量為沙蔥多糖溶液體積的1/4，氯仿正丁醇的比例為3∶1，振搖時(shí)間為30 min。此時(shí)沙蔥多糖的除蛋白率為43.82%，多糖損失率為4.67%。綜合考慮除蛋白率和多糖損失率兩個(gè)因素試驗(yàn)最后選用的工藝參數(shù)為A2B2C3。

2.4 三氯乙酸法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)結(jié)果（見表4）

表4 三氯乙酸法除蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

三氯乙酸法除沙蔥多糖溶液中蛋白正交試驗(yàn)同樣以除蛋白率（K）和多糖損失率(T)為評價(jià)指標(biāo)。由正交表可以看出，影響三氯乙酸除蛋白的因素的主次程度為B(三氯乙酸添加量)＞A（三氯乙酸濃度）＞C(振搖時(shí)間)。三氯乙酸法除蛋白的最佳工藝組合為A3B1C3，即三氯乙酸的濃度為15%，添加量是沙蔥多糖溶液體積的1倍即1∶1添加，振搖時(shí)間為20 min。此時(shí)的除蛋白率為87.33%，多糖損失率為55.59%。以多糖損失率為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，影響多糖損失率的因素的主次因素為B(三氯乙酸添加量)＞A(三氯乙酸的濃度)=C(振搖時(shí)間)，多糖損失率最小的工藝組合為A3B3C2，此時(shí)多糖損失率為21.45%。通過正交試驗(yàn)結(jié)果可知三氯乙酸除沙蔥多糖溶液中蛋白時(shí)對沙蔥多糖會(huì)造成很大損失。

3 討論

要對沙蔥多糖的組成、結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行測定分析，必須將沙蔥多糖純化。沙蔥粗多糖中含有大量的結(jié)合蛋白和游離蛋白影響沙蔥多糖的分離和提純，所以在分離提純前應(yīng)該先去除溶液中的蛋白。Sevage法和三氯乙酸法都是除蛋白的有效方法，本試驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法各有優(yōu)劣，Sevage法除蛋白率低但是多糖損失少，三氯乙酸法除蛋白率高但是多糖損失量大。方升平等（2009）[10]研究發(fā)現(xiàn)，Sevage法川芎對多糖溶液中蛋白質(zhì)去除率高達(dá)90%以上，但多糖回收率僅為40%。三氯乙酸法對川芎多糖溶液中蛋白質(zhì)去除率為37.28%，多糖回收率為73.19%。徐敏等（2007）[11]研究發(fā)現(xiàn)，Sevage法除蛋白操作復(fù)雜，多糖損失量大。三氯乙酸法除蛋白去除率高并且多糖損失量少。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果并不一致，分析原因可能是不同植物多糖溶液中結(jié)合蛋白和游離蛋白的含量相差很大。

4 結(jié)論

使用Sevage法去除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝為：Sevage試劑添加量為沙蔥多糖溶液體積的1/4，氯仿與正丁醇的比例為3∶1，振搖時(shí)間為30 min。在此條件下，沙蔥多糖的除蛋白率為43.82%，多糖損失率為4.67%。

使用三氯乙酸法去除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝為：三氯乙酸濃度為15%，與沙蔥多糖溶液按體積比1∶1添加，振搖時(shí)間為20 min。此時(shí)的除蛋白率為87.33%，多糖損失率為55.59%。

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