艾碧琛，趙國榮，賀又舜，肖碧躍

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是指感染或非感染因素作用于機(jī)體而引起的一種難以控制的全身性瀑布式炎癥反應(yīng)綜合征，可以痊愈，也常發(fā)展成膿毒性休克和多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。引起SIRS的原因有感染性因素與非感染性因素兩個(gè)方面，其中感染性因素占70%左右，又以革蘭氏陰性細(xì)菌為主，但臨床上發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌感染使用抗革蘭陰性菌的抗生素療效不佳，于是人們開始注意到細(xì)菌產(chǎn)物的作用，近年研究得較多的是內(nèi)毒素，即脂多糖(LPS)。LPS進(jìn)入血液循環(huán)后，形成內(nèi)毒素血癥，通?？蓪?dǎo)致SIRS、MODS、彌漫性血管內(nèi)凝血等，病死率極高。感染性疾病是溫病學(xué)研究的主要內(nèi)容，由感染因素所致的內(nèi)毒素血癥，屬中醫(yī)學(xué)“溫病”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，內(nèi)毒素血癥系外感六淫，或內(nèi)有郁熱，邪毒化火，蓄而成毒，熱毒內(nèi)盛，邪毒內(nèi)陷而成，溫病衛(wèi)、氣、營、血階段中均存在內(nèi)毒素血癥［1］。葉天士創(chuàng)立的衛(wèi)氣營血辨證至今300多年，一直有效指導(dǎo)臨床辨證治療感染性疾病。隨著對(duì)SIRS、內(nèi)毒素血癥認(rèn)識(shí)的深入，以及近年中醫(yī)衛(wèi)氣營血辨證對(duì)非典型性肺炎、H1N1流感等疾病的確切防治效果，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到衛(wèi)氣營血辨證診療感染性疾病的有效性［2］。因此，衛(wèi)氣營血辨證防治SIRS的研究成為了溫病學(xué)的新任務(wù)。要進(jìn)行此項(xiàng)研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是必不可少的研究途徑，我們首先應(yīng)該在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中找到內(nèi)毒素血癥與溫病衛(wèi)氣營血辨證的相關(guān)性，才能為進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

發(fā)熱是溫病的基本癥狀，兔的體溫變化十分靈敏，最易產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)典型、恒定，所以我們選擇兔作為模型動(dòng)物，以大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)攻毒，復(fù)制內(nèi)毒素血癥模型。實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們所用的兔品種為新西蘭大耳白兔;LPS購自美國Sigma公司;血清學(xué)為O111:B4，批號(hào)118K4052。

2 確定造模方法

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用LPS造內(nèi)毒素血癥或膿毒癥兔模型的方法較多，如有的采用家兔耳緣靜脈一次注射足劑量 LPS 的方法［3］，也有通過上腔靜脈［4］或門靜脈［5］、頸靜脈［6］持續(xù)微量輸注 LPS 的方法，還有二次打擊造模法，即一次打擊后間隔24h后再進(jìn)行二次打擊［5］等等。因?yàn)槲覀兊膶?shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍で髢?nèi)毒素血癥與溫病衛(wèi)氣營血證候的相關(guān)性，參考文獻(xiàn)報(bào)道的各種造模方法，遵循復(fù)制動(dòng)物模型要盡可能與人類疾病相似的原則，我們認(rèn)為一次打擊更符合臨床中溫病發(fā)生的大多數(shù)情況，即感邪即發(fā)，同時(shí)也考慮到復(fù)制動(dòng)物模型的易行性以及便于今后開展進(jìn)一步研究的適用性，我們最終選擇耳緣靜脈一次注射LPS的方式。

關(guān)于LPS的注射劑量，因?yàn)椴煌逍?、或相同血清型但不同廠家生產(chǎn)的LPS，即使劑量相同，復(fù)制的模型在病理反應(yīng)和病證特征方面也不具有良好的可重復(fù)性［7］，而且此類LPS為酚提取的LPS，該種提取方式可以造成成品中有超過60%的RNA和不超過1%的蛋白，批間差異比較大，所以即使是相同血清型不同批號(hào)的LPS，也會(huì)產(chǎn)生不一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們?yōu)榱藢ふ覍?shí)驗(yàn)最合適的內(nèi)毒素造模劑量，由小到大分別嘗試了 1μg/kg、3μg/kg、5μg/kg、10μg/kg 和 15μg/kg 等大小不同的多個(gè)劑量，發(fā)現(xiàn) 1μg/kg、3μg/kg、5μg/kg 三個(gè)劑量攻毒后，實(shí)驗(yàn)兔有發(fā)熱及相關(guān)癥狀體征出現(xiàn)，但癥狀較輕，大多數(shù)很快(不超過8h)恢復(fù)正常，不利于觀察營分證和血分證，說明這幾個(gè)劑量毒力較小。于是加大劑量至 10μg/kg、15μg/kg，發(fā)現(xiàn)用 15μg/kg 的劑量攻毒后，有接近一半的實(shí)驗(yàn)兔在8h內(nèi)即出現(xiàn)死亡，時(shí)間太短，又不利于衛(wèi)氣營血階段性的觀察，而在10μg/kg的攻毒劑量上，實(shí)驗(yàn)兔有相對(duì)較好的癥狀體征由輕到重的階段性表現(xiàn)，最后我們確定10μg/kg為實(shí)驗(yàn)中內(nèi)毒素血癥的造模用劑量。

3 分析內(nèi)毒素血癥兔的癥狀、體征與溫病衛(wèi)氣營血證候的相似點(diǎn)

通過反復(fù)觀察實(shí)驗(yàn)兔在LPS攻毒后的癥狀體征的變化，我們認(rèn)為在10μg/kg劑量攻毒后，內(nèi)毒素血癥兔出現(xiàn)了較為有規(guī)律的三個(gè)階段:第1階段(攻毒后1～2h)、第2階段(攻毒后2～6h)，第3階段(攻毒后6～36h)，并且3個(gè)階段分別與衛(wèi)、氣、營血分證候相似［8］。

3.1 第1階段癥狀、體征及其與衛(wèi)分證的相似點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)中第1階段模型兔體溫開始升高，心率、呼吸增快，聳毛、發(fā)抖、噴嚏，這與溫病衛(wèi)分證溫邪初襲人體肌表所致的發(fā)熱惡寒相似。因?yàn)樾l(wèi)分證是溫邪初襲衛(wèi)表，邪正交爭于衛(wèi)分所致，以發(fā)熱、微惡風(fēng)寒、口微渴為辨證要點(diǎn)。隨著時(shí)間增加，在攻毒后接近2h的時(shí)候，聳毛、發(fā)抖、噴嚏、流涕癥狀逐漸消失，體溫繼續(xù)升高，同時(shí)部分兔開始出現(xiàn)耳廓發(fā)熱、充血，類似人類溫病由衛(wèi)分逐漸傳入氣分的傳變過程。

3.2 第2階段癥狀、體征及其與氣分證的相似點(diǎn)

攻毒后的第2～6h內(nèi)，模型兔出現(xiàn)小便黃、呼吸明顯增快增粗、心率增快，耳廓發(fā)熱、充血明顯以及結(jié)膜充血，而且攻毒后體溫升高的最高值出現(xiàn)在這個(gè)階段內(nèi)，反映這個(gè)階段熱勢極盛，這與氣分證相似。溫病氣分證是感邪后，整體氣機(jī)受郁，正氣奮起抗邪，邪正劇爭，熱熾津傷，以發(fā)熱不惡寒、口渴、苔黃為主要表現(xiàn)。同時(shí)，氣分證的病位較為廣泛，涉及肺、脾、胃、腸等多臟腑，實(shí)驗(yàn)中此階段有相當(dāng)一部分兔出現(xiàn)了大便溏瀉、水樣便或黏液便等，這也反映病位由表入里，類似由衛(wèi)分證進(jìn)入氣分證。

3.3 第3階段癥狀、體征及其與營、血分證的相似點(diǎn)

溫病營分證以營熱陰傷、擾神竄絡(luò)為主要特點(diǎn)，身熱夜甚、心煩譫語、舌質(zhì)絳紅為辨證要點(diǎn);血分證以動(dòng)血耗血、瘀熱內(nèi)阻、進(jìn)而臟氣衰竭為主要病機(jī)變化，以急性多部位、多竅道出血、斑疹密布及舌質(zhì)深絳為其辨證要點(diǎn)。在3階段即第6～36h內(nèi)，模型兔體溫、呼吸、心率均比2階段略降，精神逐漸萎靡，活動(dòng)度和靈敏度明顯下降，便血、耳廓發(fā)涼、結(jié)膜充血明顯，出現(xiàn)口周青紫、耳廓青紫或有瘀點(diǎn)瘀斑、眼球突出、鼻衄、嗜睡、全身癱軟無力、角弓反張、抽搐和死亡。這些與溫邪入營、擾神竄絡(luò)的營分證以及動(dòng)血耗血、瘀熱內(nèi)阻、進(jìn)而臟氣衰竭的血分證相似。但是，我們的實(shí)驗(yàn)未能將營分證和血分證二者從癥狀體征或時(shí)間上截然分開。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，從氣分證向營、血分傳變時(shí)，更多出現(xiàn)的是由氣分越期進(jìn)入血分、或者出現(xiàn)營分證、血分證重疊，導(dǎo)致二者難以嚴(yán)格區(qū)分。

4 實(shí)驗(yàn)兔具有較明顯的個(gè)體差異性

與臨床患者有個(gè)體差異一樣，實(shí)驗(yàn)兔也有十分明顯的個(gè)體差異。如攻毒后，大部分模型兔出現(xiàn)了較為有規(guī)律的類似人類衛(wèi)、氣、營、血階段表現(xiàn)，而有些兔經(jīng)過2階段(氣分證)后，并沒有接著出現(xiàn)3階段(營分證或血分證)的癥狀，而是癥狀和體征逐漸消失，又恢復(fù)到正常;還有個(gè)別兔在攻毒后2～3h仍然有聳毛、噴嚏、流涕等類似衛(wèi)分證的表現(xiàn)，這又類似于衛(wèi)氣營血辨證特殊傳變中的自愈或不傳。而有個(gè)別兔在攻毒后5h左右已出現(xiàn)便血;還有一只兔在攻毒后1.5h即出現(xiàn)抽搐而死亡，這又類似“直中肝經(jīng)”。

5 內(nèi)毒素血癥兔與人類衛(wèi)氣營血證候存在不同

雖然內(nèi)毒素血癥兔表現(xiàn)出了許多與衛(wèi)氣營血證候相似之處，但仍然有一些不同。如在攻毒后至0.5h之間，除了體溫升高外，模型兔開始出現(xiàn)懶動(dòng)、蜷臥、少飲少食等癥狀，但對(duì)人類而言，在感邪的初期，以發(fā)熱惡寒為主要表現(xiàn)，而沒有懶動(dòng)、蜷臥等癥狀，少飲少食等在感邪的初期應(yīng)該也并不明顯。再如，一些在溫病臨床中比較重要的衛(wèi)氣營血證辨證要點(diǎn)的癥狀體征，如渴飲、煩躁不安等精神方面的改變及舌象變化等，自始至終都沒有出現(xiàn)。

6 從中醫(yī)證候動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)的特點(diǎn)來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

我們實(shí)驗(yàn)的目的是從內(nèi)毒素血癥模型中復(fù)制溫病衛(wèi)氣營血模型，采用的是病因模擬的方法，即選擇造成與臨床證型相仿的治病因素(LPS)，作用于動(dòng)物機(jī)體使其產(chǎn)生類似臨床證候(衛(wèi)氣營血證候)的模型。但復(fù)制中醫(yī)“證”的動(dòng)物模型難度較大，因?yàn)橹嗅t(yī)“證”是疾病的病因、病位及病邪性質(zhì)的概括，且臨床多以病人主觀感覺反映出來，確切的客觀指標(biāo)又還沒有確定下來，所以多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，目前只有盡可能從“證”的臨床辨證標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)中醫(yī)“證”的動(dòng)物模型［9］。但由于模型動(dòng)物和人處在生物進(jìn)化樹的不同層次，所以會(huì)出現(xiàn)模型動(dòng)物與人對(duì)刺激的反應(yīng)不同的現(xiàn)象，如整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中模型兔的舌象變化并不明顯;而攻毒初期模型兔即出現(xiàn)懶動(dòng)、蜷臥、少飲少食等較明顯的癥狀;即使是在第二階段的高熱狀態(tài)下，也沒有觀察到渴飲、煩躁不安等精神改變，更不用說心煩譫語這些癥狀了。

此外，中醫(yī)證候有相當(dāng)一部分病情資料，用中醫(yī)傳統(tǒng)的望、聞、問、切診察方法在動(dòng)物身上難以收集，所以模型的診斷依據(jù)應(yīng)該可以作非原則性的變通［10］。如發(fā)熱，古代醫(yī)家通過縝密的臨床觀察和思辨，將衛(wèi)氣營血證不同的熱型進(jìn)行定性，借以辨別各證，如衛(wèi)分證是發(fā)熱、微惡風(fēng)寒并見，氣分證但熱不惡寒，營分證身熱夜甚。但是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，這些不同的熱型是很難表現(xiàn)出來的，不過我們發(fā)現(xiàn)體溫高低不同階段是有差異的。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第1階段(與衛(wèi)分證相關(guān))開始出現(xiàn)發(fā)熱，但熱勢不高;第2階段(與氣分證相關(guān))的發(fā)熱程度為三階段中最高的，而到了第3階段(與營血分證相關(guān))時(shí)，發(fā)熱程度又有減輕。應(yīng)該說，三個(gè)階段體溫高低的動(dòng)態(tài)變化，與衛(wèi)分證發(fā)熱、微惡風(fēng)寒，氣分證但熱不惡寒，營分證身熱夜甚的熱型變化是有一致性的。再看，對(duì)人類來說，感邪初期的一個(gè)重要癥狀就是發(fā)熱惡寒，但惡寒是患者的自我感覺癥狀，無法在模型兔上檢測出來，就只能通過分析惡寒的基本特征，在模型兔身上找到可供診斷的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)中我們觀察到在第1階段，有部分模型兔出現(xiàn)了聳毛，應(yīng)該就可以看成是惡寒的表現(xiàn)。

綜上所述，從中醫(yī)證候動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)的特點(diǎn)來看，其對(duì)中醫(yī)證候動(dòng)物模型的復(fù)制有一定的包容性，只要其表現(xiàn)和體征與“證”的臨床表現(xiàn)大致相同，能反映中醫(yī)“證”的特點(diǎn)，則其模型就可以認(rèn)為是較為成功的［7］。所以總的來說，從癥狀和體征來看，實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)毒素血癥兔模型反映出了較明顯的衛(wèi)分證、氣分證、營血分證三類證候特征，從內(nèi)毒素血癥模型復(fù)制溫病衛(wèi)氣營血模型是可行的。當(dāng)然，判斷建立證候模型的真實(shí)性及與臨床的一致性，還需要通過實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測以及治療反證等途徑來判斷，我們將在下一步的實(shí)驗(yàn)中對(duì)此進(jìn)行完善。

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