朱詠梅，朱來(lái)華，鄭小龍，王宮璞，王 琰

（1.青島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266000；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266002）

FMD是由FMDV引起的偶蹄類(lèi)動(dòng)物烈性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入必須通報(bào)的動(dòng)物疫病。該病傳播快、宿主范圍廣、發(fā)病率高，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成極大威脅。近年來(lái)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，口蹄疫是重大的潛在威脅。與發(fā)達(dá)國(guó)家通常采取的撲殺政策不同，發(fā)展中國(guó)家普遍采用免疫的方法來(lái)控制該病。因此，如何快速、可靠地區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物，對(duì)于FMD的防制以及國(guó)際貿(mào)易尤為重要。

基于動(dòng)物感染FMDV后，既能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體，又能產(chǎn)生NSP抗體，而疫苗免疫動(dòng)物主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生FMDV結(jié)構(gòu)蛋白抗體，與結(jié)構(gòu)蛋白相比，非結(jié)構(gòu)蛋白的變異較少，相對(duì)保守[1]。在FMD診斷中，區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物是一項(xiàng)十分重要的內(nèi)容，鑒別自然感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物也是OIE判定一個(gè)國(guó)家有無(wú)FMD流行的依據(jù)。近年來(lái)，陸續(xù)建立了檢測(cè)FMDV NSP抗體的診斷方法，以區(qū)分FMDV感染動(dòng)物和注射疫苗動(dòng)物。以下就FMD中NSP的研究進(jìn)展綜述如下。

1 FMDV相關(guān)NSP的種類(lèi)

FMDV的NSP是指除了衣殼蛋白1A、1B、1C、1D和它們的前體蛋白之外的所有由病毒編碼但不參與病毒衣殼組成的蛋白，包括成熟蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及它們的前體。NSP參與病毒的復(fù)制、多聚蛋白的裂解和病毒顆粒的組裝過(guò)程。其中L和3C能抑制宿主細(xì)胞的蛋白合成，在病毒蛋白的成熟裂解過(guò)程中作為蛋白酶裂解聚蛋白，2A為P1/2A間裂解提供識(shí)別序列2BC、2C、3AB和3CD形成復(fù)制復(fù)合物，為病毒RNA的合成創(chuàng)造條件，與裝配有關(guān)[1]。

1966年Cowan等[2]發(fā)現(xiàn)一種病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗原（即3D）僅與感染動(dòng)物血清反應(yīng)，由此建立的免疫擴(kuò)散試驗(yàn)與動(dòng)物食道咽部病毒分離技術(shù)相結(jié)合，曾被認(rèn)為是一種可靠的鑒別診斷方法。但后來(lái)發(fā)現(xiàn)，反復(fù)接種滅活疫苗的動(dòng)物體內(nèi)會(huì)不同程度地產(chǎn)生抗3D抗體，該方法受到質(zhì)疑。近年來(lái)，開(kāi)始研究用其他非結(jié)構(gòu)蛋白取代3D來(lái)區(qū)分注苗動(dòng)物和感染動(dòng)物。Berger等[3]研究發(fā)現(xiàn)，血清中存在NSP抗體可以作為感染FMD康復(fù)動(dòng)物的標(biāo)志，若血清中同時(shí)存在至少2種NSP抗體（3D抗體除外）就可以斷定該動(dòng)物感染過(guò)FMDV，但如血清中不存在一種或所有的NSP抗體，并不能肯定該動(dòng)物從來(lái)就沒(méi)有感染過(guò)FMDV。

Rodriguez等[4]對(duì)感染FMDV的豬和疫苗接種豬體內(nèi)的NSP免疫原性及特異性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)3ABC抗體是由活FMDV在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，因此3ABC最適合用于鑒別FMDV感染豬和疫苗接種豬，并指出抗3ABC抗體在感染后2周即可檢測(cè)到。Lubroth等[5]發(fā)現(xiàn)，血清中2C和3ABC抗體的存在可作為區(qū)分FMD恢復(fù)動(dòng)物（帶毒者）和疫苗接種動(dòng)物。Mackey等[6]指出，2C、3A、3ABC 抗體的存在也可以作為鑒別感染和疫苗接種動(dòng)物的指標(biāo)，并且對(duì)于牛和豬血清，3ABC是最為可靠的、可單獨(dú)使用的指標(biāo)?？?ABC抗體在感染后早期就出現(xiàn)，并且在血清中維持可被檢測(cè)水平的時(shí)間比任何其他的NSP都長(zhǎng)[7]。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，各國(guó)研究者通過(guò)對(duì)2C、3A、3ABC等FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白的深入研究，發(fā)現(xiàn)針對(duì)F3ABC、3B的血清抗體水平可以作為區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物的指標(biāo)。在現(xiàn)代疫苗加工過(guò)程中，2C、3A、3B和3C等非結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)被去除，因此免疫動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)NSP的抗體，只會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)病毒衣殼蛋白的抗體。而當(dāng)動(dòng)物感染FMDV并出現(xiàn)病毒復(fù)制后，無(wú)論表現(xiàn)為臨床或亞臨床癥狀，動(dòng)物都會(huì)出現(xiàn)2種抗體，一種是針對(duì)衣殼蛋白的抗體，一種是針對(duì)NSP的抗體，后者可以用來(lái)區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物[8]。

2 通過(guò)測(cè)定NSP抗體區(qū)分感染動(dòng)物和注射疫苗動(dòng)物的研究進(jìn)展

建立檢測(cè)NSP抗體試驗(yàn)的目的之一是試圖區(qū)分感染動(dòng)物和注射疫苗動(dòng)物。OIE的動(dòng)物衛(wèi)生法典規(guī)定要求：宣布無(wú)FMD的國(guó)家應(yīng)進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)，以證明本國(guó)確實(shí)無(wú)FMDV感染。FMDV結(jié)構(gòu)蛋白抗體的存在是曾接觸過(guò)FMDV的證據(jù)（通過(guò)疫苗接種或感染），因此，在非疫苗接種的國(guó)家，檢測(cè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體已經(jīng)成為一種血清學(xué)監(jiān)測(cè)方法。在非接種疫苗或近期內(nèi)不用疫苗或已停止接種疫苗的國(guó)家將檢測(cè)NSP抗體作為間接評(píng)估病毒在畜群中活動(dòng)的標(biāo)志。

在區(qū)分感染動(dòng)物與注射疫苗動(dòng)物之前，還必須先了解FMDV的NSP的體液免疫和細(xì)胞免疫兩類(lèi)免疫應(yīng)答的特性。Bergerman[9]等報(bào)道了利用放射免疫沉淀法（RIP）對(duì)有限數(shù)量動(dòng)物進(jìn)行研究的結(jié)果，闡述了NSP在注射疫苗動(dòng)物和感染動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。

2.1 體液免疫

在小核糖核酸病毒科中只有FMDV和心病毒有編碼前導(dǎo)蛋白L的基因。因此，檢測(cè)FMDV感染動(dòng)物L(fēng)抗體應(yīng)當(dāng)是高度特異的。遺憾的是，L蛋白的免疫原性比其他的NSP低。不是所有感染過(guò)的動(dòng)物都產(chǎn)生L抗體，即使產(chǎn)生應(yīng)答，持續(xù)時(shí)間也很短暫。L抗體應(yīng)答并結(jié)合其他NSP應(yīng)答的檢測(cè)是FMDV感染的證據(jù)。感染動(dòng)物產(chǎn)生2B抗體，并證明它含有B細(xì)胞表位的肽，但至今尚未建立能用于檢測(cè)2B抗體的重復(fù)性好的ELISA。Meyer[10]等報(bào)道了用桿狀病毒表達(dá)的2C作為抗原的ELISA。Mezencio[11]等檢測(cè)了各種來(lái)源的注射疫苗動(dòng)物和感染動(dòng)物血清中的2C抗體，發(fā)現(xiàn)注射疫苗動(dòng)物的2C抗體很少有陽(yáng)性，而FMDV感染動(dòng)物2C抗體則全部是陽(yáng)性。Mezencio[11]等亦證明，牛和豬2C抗體的衰退比3ABC抗體衰退要快，并且注射疫苗的牛體偶爾也能檢測(cè)到2C抗體。

已發(fā)表的資料表明，檢測(cè)3ABC多肽抗體是確定感染的標(biāo)記之一，許多研究者都認(rèn)同這一觀(guān)點(diǎn)。在組成3ABC多聚蛋白的3種蛋白中，3A的免疫原性最好，3C誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較弱，但它包含在3ABC多肽中能提高3ABC抗原作為感染標(biāo)志的可靠性。有些研究報(bào)告還進(jìn)一步證實(shí)了3ABC抗原作為感染標(biāo)記的可靠性。Mackey等[6]比較了3ABCELISA和EITB鑒別感染動(dòng)物的效果，認(rèn)為3ABCELISA是鑒別感染動(dòng)物的有效方法，3ABCELISA陽(yáng)性血清或可疑血清可用EITB進(jìn)一步確證。Brochi[12]等利用3ABCELISA檢查1996年在巴爾干地區(qū)流行的FMDVA型血清，有臨床癥狀的動(dòng)物都檢出了3ABC抗體，而注射過(guò)疫苗的動(dòng)物，不管疫苗的來(lái)源、佐劑類(lèi)型、接種次數(shù)，3ABC抗體都是陰性。

3D蛋白是NSP中免疫原性最好的一個(gè)，雖然只測(cè)定3D抗體不能區(qū)分感染動(dòng)物和注射疫苗動(dòng)物，但它仍可作為早先接觸過(guò)非特異FMDV抗原的指標(biāo)。在3ABC陽(yáng)性動(dòng)物血清中檢出3D抗體為證明早先感染進(jìn)一步提供了證據(jù)，反之，檢測(cè)到FMDV結(jié)構(gòu)蛋白和3D抗體，則是早先注射過(guò)疫苗的標(biāo)志。

2.2 細(xì)胞免疫

FMDV感染可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，但產(chǎn)生免疫應(yīng)答的細(xì)胞成分尚不清楚，有報(bào)道通過(guò)體外增殖和感染動(dòng)物體內(nèi)延遲過(guò)敏反應(yīng)（DTH），能夠證明T2細(xì)胞對(duì)FMDV NSP，特別是2B、2C和3D的免疫應(yīng)答。DTH反應(yīng)有可能用于區(qū)分感染動(dòng)物和注射疫苗動(dòng)物的研究正在進(jìn)行之中。

3 NSP抗體診斷應(yīng)用及發(fā)展前景

1991年，Neitart[13]等建立了酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)印試驗(yàn)（EITB）技術(shù)，可以同時(shí)檢查血清中幾種NSP抗體。不久，Bergerman[9]證實(shí)，檢測(cè)FMDVNSP抗體水平可以用于區(qū)分感染和免疫動(dòng)物。Bergmann等比較了分別以3A、3B、2C、3D和3ABC作為診斷抗原，應(yīng)用間接ELISA試驗(yàn)檢測(cè)感染牛的敏感性和準(zhǔn)確性，結(jié)果以3A、3B和3ABC為抗原檢出的結(jié)果與病毒分離和EITB的檢出結(jié)果一致，尤其是3ABC的效果最好。在單個(gè)NSP中，研究者一致認(rèn)為多聚蛋白3ABC抗體是檢測(cè)FMD預(yù)先感染的最可靠單一指示器，并推薦檢測(cè)3ABC抗體的試驗(yàn)。

Berger等[3]研究發(fā)現(xiàn)，血清中存在NSP抗體可以作為感染FMD康復(fù)動(dòng)物的標(biāo)志，若血清中同時(shí)存在至少2種NSP抗體（3D抗體除外）就可以斷定該動(dòng)物感染過(guò)FMDV，但如血清中不存在一種或所有的NSP抗體，并不能肯定該動(dòng)物從來(lái)就沒(méi)有感染過(guò)FMDV。Rodriguez等[4]對(duì)感染FMDV的豬和疫苗接種豬體內(nèi)的NSP免疫原性及特異性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)3ABC抗體是由活FMDV在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，口蹄疫疫苗免疫的動(dòng)物很少有3ABC、3AB等NSP抗體，3ABC和3AB檢測(cè)方法常用于檢測(cè)動(dòng)物是否感染口蹄疫病病毒。其中3ABC最適合用于鑒別FMDV感染豬和疫苗接種豬，抗3ABC抗體在感染后2周即可檢測(cè)到，并且在血清中維持可被檢測(cè)水平的時(shí)間比任何其他的NSP都長(zhǎng)，適用于大批量的動(dòng)物普查，用于找到隱性感染口蹄疫病毒的動(dòng)物。

目前學(xué)者確認(rèn)以生物工程技術(shù)制備的3ABC作為抗原的ELISA方法是區(qū)分FMDV自然感染和疫苗免疫動(dòng)物的理想方法，疫苗生產(chǎn)工藝，在病毒純化過(guò)程中去除了絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，因此滅活疫苗免疫動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體產(chǎn)生，而自然感染動(dòng)物體內(nèi)既有結(jié)構(gòu)蛋白抗體又有非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體，因此，檢測(cè)FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測(cè)隱性感染動(dòng)物，而且可以區(qū)分自然感染動(dòng)物和滅活疫苗免疫動(dòng)物。美國(guó)率先推出了FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA診斷試劑盒，在許多國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行區(qū)域性試驗(yàn)，并在美國(guó)、阿根廷和中國(guó)臺(tái)灣省申請(qǐng)了專(zhuān)利。

在國(guó)際貿(mào)易中，實(shí)施FMD血清學(xué)檢驗(yàn)的目的是鑒別動(dòng)物是否有帶入FMDV的危險(xiǎn)，由于已感染的牛能夠形成持續(xù)性感染，不管是否接種過(guò)疫苗，所有血清陽(yáng)性的牛都認(rèn)為有危險(xiǎn)，并將其剔除。對(duì)于進(jìn)出境檢疫樣品的血清學(xué)檢驗(yàn)，要強(qiáng)調(diào)試驗(yàn)絕對(duì)敏感，但對(duì)于流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，強(qiáng)調(diào)試驗(yàn)的特異性，若FMD疫苗含有殘留的微量NSP，也能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的抗體，特別是重復(fù)注射疫苗后尤為明顯，試驗(yàn)要求能夠可靠地確定動(dòng)物是否已感染了FMDV，不管它們是否注射過(guò)疫苗。在野外檢測(cè)重復(fù)注射疫苗動(dòng)物血清時(shí)，偶爾也能檢測(cè)到NSP抗體陽(yáng)性或可疑抗體。Bergerman等[9]還發(fā)現(xiàn)，年齡大的、重復(fù)注射疫苗的動(dòng)物偶爾在EITB試驗(yàn)中出現(xiàn)1條或1條以上NSP陽(yáng)性反應(yīng)帶，對(duì)所有 5條帶（2C、3B、3ABC、3D）都發(fā)生反應(yīng)的非常罕見(jiàn)，只有1頭年齡最大的牛出現(xiàn)過(guò)這種情況。已發(fā)表的研究結(jié)果表明，檢測(cè)FMDVNSP（非3D）抗體不是早先感染的絕對(duì)證據(jù)，還須考慮血清陽(yáng)性動(dòng)物的年齡和感染史。在制定檢測(cè)病毒活動(dòng)的血清學(xué)監(jiān)測(cè)計(jì)劃時(shí)，考慮動(dòng)物的年齡和注射疫苗史同樣重要。Bergman建議，為了避免由于注射疫苗或在以前接觸過(guò)抗原產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果的問(wèn)題，采樣的動(dòng)物應(yīng)限制在2歲以下。

有學(xué)者研究了注射疫苗后再感染牛的NSP抗體應(yīng)答，以確定注射疫苗NSP轉(zhuǎn)陽(yáng)后再接觸FMDV的動(dòng)物是否得到保護(hù)。Brochi等[14]證明，大多數(shù)注射疫苗的牛，在攻毒后3ABC抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，可是沒(méi)有檢查過(guò)這些牛的帶毒狀況。因此，尚不能把3ABC抗體與攻擊后是否形成感染聯(lián)系在一起。Sorensen等[15]和Mackay等[16]檢查采自注射過(guò)疫苗然后攻毒牛的血清，發(fā)現(xiàn)某些注射過(guò)疫苗又進(jìn)行攻擊后形成持續(xù)性感染的牛NSP抗體不轉(zhuǎn)陽(yáng)。另有證據(jù)表明，帶毒動(dòng)物血清轉(zhuǎn)陽(yáng)與形成持續(xù)感染的水平相關(guān)，而持續(xù)感染的水平又與接種疫苗的效力有關(guān)。不管動(dòng)物是否接種過(guò)疫苗，3ABC抗體的檢測(cè)（通常與其它NSP中的1種或1種以上的抗體聯(lián)合）是確定是否感染FMDV的證據(jù)。以畜群整體而言，檢測(cè)3ABC抗體能夠監(jiān)測(cè)病毒在注射疫苗牛群中的活動(dòng)情況。就單個(gè)動(dòng)物而言，注射疫苗后呈陰性結(jié)果并不意味著該動(dòng)物從來(lái)沒(méi)有接觸過(guò)FMDV。

因此在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，如僅用3ABC-ELISA單一方法，不可避免就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題。所以還需要一種更特異的快速診斷方法。EITB是有酶聯(lián)免疫和免疫印跡試驗(yàn)相結(jié)合而開(kāi)發(fā)的試驗(yàn)，可同時(shí)檢測(cè)最常見(jiàn)的5種非結(jié)構(gòu)蛋白（3ABC，3D，2C，3B和3A）。而在滅活疫苗中，5種非結(jié)構(gòu)蛋白可能同時(shí)微量存在，或可能1～2種出現(xiàn)較多，同時(shí)大量出現(xiàn)這5種非結(jié)構(gòu)蛋白的可能性很低，因此判定結(jié)果時(shí)下列3種情況為陰性：（1）不出現(xiàn)5條印跡；（2）某一印跡不明顯，濃度低于陽(yáng)性對(duì)照；（3）印跡明顯（等同或高于陽(yáng)性）的條帶不超過(guò)2條。目前，3ABC-ELISA和EITB聯(lián)合檢測(cè)診斷系統(tǒng)已由泛美地區(qū)口蹄疫診斷中心（OIE口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室）開(kāi)發(fā)，廣泛應(yīng)用于泛美地區(qū)口蹄疫的診斷、監(jiān)控，并得到OIE認(rèn)可[9]。首先，應(yīng)用3ABC-ELISA檢測(cè)非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體進(jìn)行初篩，如3ABC-ELISA陽(yáng)性或可疑，再用EITB檢測(cè)五種非結(jié)構(gòu)蛋白抗體（3ABC，3D，2C，3B和3A），如EITB仍為陽(yáng)性，再用病毒分離鑒定方法進(jìn)行確證。

目前，單獨(dú)用血清學(xué)方法不足以鑒別持續(xù)性感染（不管是否接種過(guò)疫苗），還必須應(yīng)用直接檢測(cè)病原的技術(shù)。病毒分離試驗(yàn)雖然敏感，但獲得結(jié)果要花費(fèi)幾日的時(shí)間。今后的研究是確定在野外和實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)病毒在注射疫苗畜群中的活動(dòng)及采樣的方式等。如果PCR技術(shù)進(jìn)一步自動(dòng)化，在短時(shí)間內(nèi)能夠處理大量樣品，將對(duì)動(dòng)物調(diào)運(yùn)檢疫極有價(jià)值。用附加擴(kuò)增步驟的巢式PCR或利用檢測(cè)PCR產(chǎn)物的ELISA技術(shù)能提高RT-PCR的敏感性。PCR在人醫(yī)和獸醫(yī)上的廣泛應(yīng)用促使該技術(shù)向快速、簡(jiǎn)易方向發(fā)展。毫無(wú)疑問(wèn)，PCR有可能成為鑒定FMDV帶毒者的可靠方法。

綜上所述，檢測(cè)NSP抗體試驗(yàn)在FMD診斷中的應(yīng)用具有特別的意義。檢測(cè)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白抗體仍然是鑒別動(dòng)物是否接觸過(guò)FMDV抗原最敏感、特異的方法。而檢測(cè)FMDVNSP抗體方法已經(jīng)建立，并且極其有效。只用血清學(xué)辦法不能絕對(duì)地區(qū)分自然感染與注射疫苗動(dòng)物，如果動(dòng)物既接種過(guò)疫苗又被感染，則大多數(shù)動(dòng)物的NSP抗體呈現(xiàn)陽(yáng)性，在動(dòng)物NSP抗體陽(yáng)性血清中，多聚蛋白3ABC抗體的檢測(cè)是最可靠的指示器。檢測(cè)其他的NSP，如L、2B、2C、3A或3ABC中的1個(gè)或1個(gè)以上的抗體，可為確定動(dòng)物是否感染FMDV提供了更確實(shí)的證據(jù)。以畜群或組為單位，檢測(cè)3ABC、2C和3AB抗體，能夠證明注射疫苗群是否早先感染。不能把結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性，但3ABC抗體陰性的單個(gè)動(dòng)物簡(jiǎn)單地認(rèn)為是注射過(guò)疫苗的動(dòng)物。這樣的動(dòng)物還應(yīng)當(dāng)檢查是否存在病毒，然后才能確定。只檢測(cè)3D不能區(qū)分是感染動(dòng)物還是注射疫苗動(dòng)物，因?yàn)樵S多FMD疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生3D抗體，結(jié)構(gòu)蛋白和3D蛋白抗體陽(yáng)性而其他NSP抗體陰性的動(dòng)物，是早先接種疫苗的標(biāo)志。今后的研究方向是建立一種方法，將檢測(cè)NSP抗體的方法和檢測(cè)病毒的RT-PCR結(jié)合為一體，使其能快速、可靠地鑒別是否接種過(guò)疫苗的所有感染動(dòng)物。

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