陳春霞（綜述），闞 飆（審校）

MLVA技術在沙門菌分型和分子流行病學研究中的應用

陳春霞（綜述），闞 飆（審校）

沙門菌屬是屬于腸桿菌科的一類生化特性、抗原結(jié)構(gòu)和DNA同源性等相關的革蘭陰性菌，廣泛存在于自然界，能引起多種動物感染。人源感染主要是通過污染食物從而引起的食物中毒。目前沙門菌感染是全球范圍內(nèi)最常見的食源性疾病之一［1］。全球每年估計發(fā)生13億因沙門菌導致的急性胃腸炎病例，其中300萬患者死亡［2］。在美國，估計沙門菌所致感染占所有由食源性致病菌引起感染的26%［3］，每年沙門菌感染的有140萬病例，引起17 000人住院并且將近600人死亡［4］，導致的經(jīng)濟損失每年約為24億美元［5］。我國沙門菌感染的情況也很嚴重，多年來一直居細菌性食物中毒的首位（占64%），2005年共發(fā)生沙門菌食物中毒24起，1 358人中毒，其中死亡2人［6］。

對菌株進行分離和分型是用于疾病常規(guī)監(jiān)測、流行病學研究、暴發(fā)調(diào)查和溯源追蹤的一種重要的工具，而不是僅僅為了感染性疾病的病原學診斷。多位點的可變串聯(lián)重復（VNTR）分析是近年發(fā)展起來的以PCR技術為基礎的分子分型方法，由于其操作簡單、快速、可重復性好、分辨率高并且不同的實驗室之間結(jié)果易于比較等優(yōu)點，已應用于多種細菌的分子分型［7］。國際病原菌分子分型實驗室監(jiān)測網(wǎng)絡（PulseNet）已將MLVA列為第二代分子分型方法［8］，其中沙門菌中的鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌在PulseNet中已經(jīng)分別確立了標準化方案。本文就MLVA技術及其在沙門菌流行病學研究和分析中的應用作綜述。

1 用于MLVA分析的VNTR位點的篩選

MLVA中VNTR（可變數(shù)目序列重復），由串聯(lián)重復的單一DNA原件組成［9］。許多細菌基因組DNA都含有重復序列，這些重復序列是以多拷貝形式存在在全基因組上。同一種屬的不同的單個細菌常常含有相同的重復序列但是串聯(lián)重復的數(shù)目不同，而串聯(lián)重復序列的兩側(cè)側(cè)翼區(qū)域在不同的單個菌株中顯示序列同源性，因此在重復序列的側(cè)翼區(qū)域設計引物進行PCR擴增，根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度，可以推導每一個位點的重復單位數(shù)目，從而確定串聯(lián)重復單位的拷貝數(shù)的變異情況，可以反映不同菌株的遺傳多樣性。

細菌全基因組序列測序已經(jīng)大大推進了識別用于菌株分型的VNTR的方式，從而為重復DNA的評價和對流行病學調(diào)查的應用開辟了道路。通過應用能夠快速掃描全基因組的軟件，VNTR位點能夠迅速的被定位，PCR引物可以根據(jù)側(cè)翼序列進行設計。目前用于篩選VNTR位點的常用軟件包括TRF（http：//tandem.bu.edu/trf/trf.html）［10］和TRD（http：//minisatellites.u－psud.fr）［11］。對于這兩個軟件產(chǎn)生的串聯(lián)重復位點都可以用免費在線軟件進行引物設計（www.biotools.umassmed.edu/biopass/primer3＿www.cgi）。需要強調(diào)的是這兩個軟件篩選出來的某種細菌基因組的位點，在不同菌株中大多數(shù)可能有非常低的或者沒有多態(tài)性，因此每一個位點在用于基因分型之前，應當選擇一組遺傳學無關的菌株對位點重復數(shù)的多態(tài)性進行評價［11］。

2 MLVA在沙門菌菌株分型和分子流行病學中的應用

2.1 菌株分子分型 在沙門菌感染流行中，對菌株進行準確的分子分型，對發(fā)現(xiàn)暴發(fā)和尋找感染源頭以及控制傳播是很重要的。Bj?rn－Arne Lindstedt等［12］在2003年篩選了8個VNTR位點對78株分離自1993－2002年的鼠傷寒沙門菌尤其是其中的噬菌體DT104型菌株進行DNA指紋圖譜研究，將78株菌分成了54種VNTR帶型，其中37株噬菌體DT104型菌株發(fā)現(xiàn)有28種不同的VNTR帶型。這種VNTR方法與XbaⅠ－PFGE、AFLP、整合子基因圖譜和四種基因的PCR方法進行了比較，結(jié)果顯示了VNTR方法具有分辨率高、簡單快速、重復性好、結(jié)果易于解釋和可以完全自動化分析等多種優(yōu)點，隨后MLVA方法用于多種沙門菌血清型的基因分型的報道也越來越多［13］，并且展示了非常好的分型結(jié)果。Liu等［14］應用3個VNTR位點用多重PCR方法對來自新加波、印度尼西亞、印度、孟加拉、馬來西亞和尼泊爾等幾個亞洲國家的傷寒沙門菌進行分子分型，59株菌被分成了49種不同的型別，并且同一個國家內(nèi)和不同國家間的菌株也都顯示高水平的VNTR圖譜異質(zhì)性，提示了這種基于3個VNTR位點的方法具有高度的分辨率，能夠為傷寒沙門菌的流行病學分析提供了非常有用的信息。Malorny等［15］報道了一種新的具有高分辨率的MLVA方法用于腸炎沙門菌的分型，應用9個位點的MLVA方法對240株分離自人、動物、食品和環(huán)境的包含23中噬菌體型的腸炎沙門菌進行分析，共分成79種不同的MLVA型，MLVA的Simpson多樣性指數(shù)在研究的菌株樣本中是0.919。研究中62株腸炎沙門菌噬菌體PT4型菌株分成了24種MLVA型，81株腸炎沙門菌噬菌體PT8型菌株分成21種型，因而這9個位點的MLVA方法是非常有用的用于區(qū)分腸炎沙門菌尤其是單一的噬菌體型菌株。Davis等［16］用6個位點的 MLVA方法將132株紐波特沙門菌菌株分成40種不同的型別，每一種型別的菌株數(shù)目從1－26不等，Simpson多樣性指數(shù)是0.91，略高于PFGE。MLVA的高分辨率和能夠更快的獲得結(jié)果使得其成為紐波特沙門菌區(qū)域監(jiān)測和暴發(fā)調(diào)查的強大的補充或替代的技術。Tien等［17］比較了PFGE和MLVA兩種分型技術用于甲型副傷寒沙門菌的分子分型，XbaⅠ－PFGE和BlnⅠ－PFGE兩種酶的組合將55株菌分離自南亞和東南亞的至少6個國家的跨越10年時間的甲型副傷寒菌株分成14種型，分辨指數(shù)（DI）是0.741，同樣的菌株，基于6個VNTR位點的MLVA方法能將其分成23種型別，分辨指數(shù)是0.937，顯著高于PFGE，因此認為MLVA能獲得明確的數(shù)據(jù)，是高通量的并且具有較高的分辨率，能夠成為一種選擇的分型方法補充PFGE用于甲型副傷寒沙門菌的流行病學調(diào)查。Bergamini等［18］發(fā)展了6個位點的 MLVA方案用于分析55株雞沙門菌，并且將其結(jié)果與3種酶切（XbaⅠ、SpeⅠ和XhoⅠ）的PFGE進行比較，MLVA將55株菌分成21種型，3種酶的PFGE的組合將其分成18種型，顯示MLVA的分辨率同等于3種酶的PFGE組合，但是MLVA方法易于操作，結(jié)果解釋更加直觀明了。這些研究都充分展示了MLVA方法在沙門菌的分型和監(jiān)測方面具有廣闊的應用前景，為沙門菌的監(jiān)測及防治提供了最有利的手段。

2.2 流行病學調(diào)查 傳染病的流行病學調(diào)查，在某種程度上，依賴于實驗室特征描述或分型數(shù)據(jù)。菌株分型通過從散發(fā)病例中區(qū)分暴發(fā)相關的病例，證實涉嫌的傳染源，從而推進了普通來源暴發(fā)的鑒定并且增強了流行病學調(diào)查。目前MLVA方法在沙門菌的流行病學調(diào)查和溯源的追蹤方面已經(jīng)顯示巨大的前景。Ross等［19］應用 MLVA和噬菌體分型方法作為輔助工具用于鼠傷寒沙門菌流行病學調(diào)查，結(jié)果說明了MLVA和噬菌體分型能夠為沙門菌暴發(fā)的流行病學調(diào)查提供不同的但是互補的信息。Torpdahl等［20］用 MLVA方法鑒定了一起由鼠傷寒沙門菌引起的區(qū)域暴發(fā)并且追蹤了其傳染源，所有的暴發(fā)菌株都有相同的噬菌體型、MLVA型和PFGE型，但是僅僅MLVA方法能將對照菌株和暴發(fā)菌株分開，進一步的研究發(fā)現(xiàn)一株來自豬群的菌株及其位于暴發(fā)相同地理區(qū)域的相應的屠宰場與人源菌株有相同的PFGE和MLVA型別，結(jié)合流行病學資料證實了這次區(qū)域暴發(fā)是由豬群引起的鼠傷寒沙門菌噬菌體DT12型的區(qū)域感染。其他的研究也證實了MLVA在沙門菌尤其是相同沙門菌血清型的不同噬菌體型的菌株引起的多地暴發(fā)調(diào)查和溯源追蹤方面是一種非?？煽康墓ぞ撸?1－25］。

2.3 種系發(fā)生研究 MLVA除了用于沙門菌的分子流行病學研究外，還可以了解菌株間的遺傳進化關系。細菌的變異能夠根據(jù)在特異的染色體位點上的等位基因的變異所解釋，這是MLVA為群體遺傳分析和種系發(fā)生學推論提供了理論依據(jù)。Octavia和Lan［26］用9個位點的 MLVA方法分析傷寒沙門菌，73株分離自全球的菌株被分成70種不同的型別，種系發(fā)生分析顯示這些MLVA型別能被分成7個簇（cluster）。這些簇能被某些特定VNTR等位基因所支持，但是在每一個簇中并不是唯一包含這種特異的VNTR等位基因，因此認為VNTR的數(shù)據(jù)過于分散，不能推論確鑿的親緣關系，但是種系發(fā)生分析可以使我們確定來自同一地區(qū)的菌株是否有流行病學聯(lián)系。但Chiou等［27］認為基于較多VNTR位點組合的MLVA方法在建立菌株的種系發(fā)生關系時可能是一種非常有用的工具。他們確立了基于16個位點的MLVA方法描述鼠傷寒沙門菌的分型和種系發(fā)生研究，其中4個最可變的VNTR位點將183株不相關的鼠傷寒沙門菌和203株親緣關系相近的鼠傷寒沙門菌分別分成157和108種型，顯示了比PFGE更高的分辨率，尤其在親緣關系相近的菌株中。而這16個位點能將203株親緣關系相近的鼠傷寒沙門菌分成了118中不同的型別，種系發(fā)生樹分析呈現(xiàn)了4種不同簇，并且這4個簇分別與4種不同的噬菌體型相匹配，呈現(xiàn)了非常好的種系發(fā)生關系。因此基于一小組高度可變的位點的MLVA有極高的分辨率區(qū)分親緣關系相近的菌株，而基于一大組VNTR位點的MLVA方法更易于清楚的將菌株分成不同進化組。在發(fā)展一種新的MLVA方案時，應盡可能的找出基因組上所有的可能的VNTR位點。

3 展 望

VNTR位點的選擇對確保MLVA分型最優(yōu)操作參數(shù)具有重要意義，如太不穩(wěn)定的位點可能被包含進去，這樣就不能完全反應菌株基因型的真正的分布或者可能隱藏了一次暴發(fā)。因此MLVA分型方法中的VNTR位點組合在應用于標準化的分型方案前，需要進行大量菌株的分析驗證，包括對菌株進行實驗室內(nèi)的長期傳代，然后對子代菌株再進行分型分析，以確保每一個位點的穩(wěn)定性和可重復性。MLVA方法另外一個缺點是目前同一種沙門菌血清型的測序株太少，往往所得到的VNTR數(shù)據(jù)只能從一株菌中或者與其他沙門菌血清型的測序株比較得到的。這種從一株菌中獲得的VNTR數(shù)據(jù)可能導致某些沙門菌血清型的跨越重復區(qū)域設計引物成為問題。因為這些側(cè)翼區(qū)域可能也是有多態(tài)性的［14］。而不同沙門菌血清型具有不同的遺傳學背景，一組特定的MLVA引物組合對某種沙門菌血清型有高度的分辨率，但是對其他的沙門菌血清型可能沒有分辨能力，因此篩選每一種沙門菌血清型的合適的MLVA位點不能依賴于其他血清型公布的基因組序列。隨著基因組測序技術的進步，更多沙門菌血清型基因組被測序，MLVA必將在沙門菌的分子流行病學研究中得以廣泛的應用，并且有可能替代PFGE方法作為沙門菌的主要分型方法［28－30］。

［1］Swaminathan B，Gerner－Smidt P，Barrett T.Focus onSalmonella［J］.Foodborne Pathog Dis，2006，3（2）：154－156.

［2］Pang T，Bhutta ZA，F(xiàn)inlay BB，et al.Typhoid fever and other salmonellosis：a continuing challenge［J］.Trends Microbiol，1995，3（7）：253－255.

［3］Mead PS，Slutsker L，Dietz V，et al.Food－related illness and death in the United States［J］.Emerg Infect Dis，1999，5（5）：607－625.

［4］Voetsch AC，Van Gilder TJ，Angulo FJ，et al.FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidalSalmonellainfections in the United States［J］.Clin Infect Dis，2004，38（Suppl 3）：127－134.

［5］Callaway TR，Edrington TS，Anderson RC，et al.Gastrointestinal microbial ecology and the safety of our food supply as related toSalmonella［J］.J Anim Sci，2008，86（Suppl 14）：163－172.

［6］朱超，徐學斌.沙門菌屬血清型診斷［M］.上海：同濟大學出版社。2009：1.

［7］Lindstedt BA.Multiple－locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria［J］.Electrophoresis，2005，26（13）：2567－2582.

［8］Hyytia－Trees E，Smole SC，F(xiàn)ields PA，et al.Second generation subtyping：aproposed PulseNet protocol for multiple－locus variable－number tandem repeat analysis of Shiga toxin－producingEscherichiacoliO157 （STEC O157）［J］.Foodborne Pathog Dis，2006，3（1）：118－131.

［9］van Belkum A.The role of short sequence repeats in epidemiologic typing［J］.Curr Opin Microbiol，1999，2（3）：306－311.

［10］Benson G.Tandem repeats finder：aprogram to analyze DNA sequences［J］.Nucleic Acids Res，1999，27（2）：573－580.

［11］Denoeud F，Vergnaud G.Identification of polymorphic tandem repeats by direct comparison of genome sequence from different bacterial strains：a web－based resource［J］.BMC Bioinformatics，2004，5：4.

［12］Lindstedt BA，Heir E，Gjernes E，et al.DNA fingerprinting ofSalmonellaentericasubsp.entericaserovar typhimurium with emphasis on phage type DT104based on variable number of tandem repeat loci［J］.J Clin Microbiol，2003，41（4）：1469－1479.

［13］Kruy SL，van Cuyck H，Koeck JL.Multilocus variable number tandem repeat analysis forSalmonellaenterica subspecies［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30（4）：465－473.

［14］Liu Y，Lee MA，Ooi EE，et al.Molecular typing ofSalmonella entericaserovar typhi isolates from various countries in Asia by a multiplex PCR assay on variable－number tandem repeats［J］.J Clin Microbiol，2003，41（9）：4388－4394.

［15］Malorny B，Junker E，Helmuth R.Multi－locus variable－number tandem repeat analysis for outbreak studies ofSalmonella entericaserotype Enteritidis［J］.BMC Microbiol，2008，8：84.

［16］Davis MA，Baker KN，Call DR，et al.Multilocus variablenumber tandem－repeat method for typingSalmonellaentericaserovar Newport［J］.J Clin Microbiol，2009，47（6）：1934－1938.

［17］Tien YY，Wang YW，Tung SK，et al.Comparison of multilocus variable－number tandem repeat analysis and pulsed－field gel electrophoresis in molecular subtyping ofSalmonellaentericaserovars Paratyphi A［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2011，69（1）：1－6.

［18］Bergamini F，Iori A，Massi P，et al.Multilocus variable－number of tandem－repeats analysis ofSalmonellaentericaserotype Gallinarum and comparison with pulsed－field gel electrophoresis genotyping［J］.Vet Microbiol，2011，149（3－4）：430－436.

［19］Ross IL，Davos DE，Mwanri L，et al.MLVA and Phage Typing as Complementary Tools in the Epidemiological Investigation ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium Clusters［J］.Curr Microbiol，2011，62（3）：1034－1038.

［20］Torpdahl M，Sorensen G，Ethelberg S，et al.A regional outbreak ofS.typhimuriumin Denmark and identification of the source using MLVA typing［J］.Euro Surveill，2006，11（5）：134－136.

［21］Much P，Pichler J，Kasper S，et al.A foodborne outbreak ofSalmonellaEnteritidis phage type 6in Austria，2008［J］.Wien Klin Wochenschr，2009，121（3－4）：132－136.

［22］Heck M.Multilocus variable number of tandem repeats analysis（MLVA）－a reliable tool for rapid investigation ofSalmonellatyphimurium outbreaks［J］.Euro Surveill，2009，14（15）：1.

［23］Munnoch SA，Ward K，Sheridan S，et al.A multi－state outbreak ofSalmonellaSaintpaul in Australia associated with cantaloupe consumption［J］.Epidemiol Infect，2009，137（3）：367－374.

［24］Nygard K，Lindstedt BA，Wahl W，et al.Outbreak ofSalmonellaTyphimurium infection traced to imported cured sausage using MLVA－subtyping ［J］. Euro Surveill， 2007， 12（3）：70315.

［25］Slinko VG，McCall BJ，Stafford RJ，et al.Outbreaks ofSalmonellaTyphimurium phage type 197of multiple genotypes linked to an egg producer［J］.Commun Dis Intell，2009，33（4）：419－425.

［26］Octavia S，Lan R.Multiple－locus variable－number tandem－re－peat analysis ofSalmonellaentericaserovar Typhi［J］.J Clin Microbiol，2009，47（8）：2369－2376.

［27］Chiou CS，Hung CS，Torpdahl M，et al.Development and evaluation of multilocus variable number tandem repeat analysis for fine typing and phylogenetic analysis ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium［J］.Int J Food Microbiol，2010，142（1－2）：67－73.

［28］Ramisse V，Houssu P，Hernandez E，et al.Variable number of tandem repeats inSalmonellaentericasubsp.entericafor typing purposes［J］.J Clin Microbiol，2004，42（12）：5722－5730.

［29］Gilbert GL.Using MLVA to type strains ofSalmonellaTyphimurium in New South Wales［J］.N S W Public Health Bull，2008，19（1－2）：29－31.

［30］Boxrud D，Pederson－Gulrud K，Wotton J，et al.Comparison of multiple－locus variable－number tandem repeat analysis，pulsedfield gel electrophoresis，and phage typing for subtype analysis ofSalmonellaentericaserotype Enteritidis［J］.J Clin Microbiol，2007，45（2）：536－543.

R378.2

A

1002－2694（2011）10－0929－04

闞飆，Email：kanbiao＠icdc.cn

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所腹瀉病室/國家傳染病預防控制重點實驗室，北京 102206

2011－03－14；

2011－06－17