陳愛(ài)平,陳建輝,楊勁松,林 杰

2.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院教學(xué)基地 ,福州 350001

在全國(guó)食物中毒事件分析中,微生物類引起的食物中毒事件一直占據(jù)著食物中毒原因分類的首位,其中又以細(xì)菌性的病原體如副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門(mén)菌等為主[1-2]。2010年我們檢測(cè)了兩起群體食源性食物中毒腹瀉病原體以及一起疫苗接種偶合病例的糞便標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)可疑病原菌均為腸致瀉性大腸桿菌引起;如果只根據(jù)傳統(tǒng)的血清、生化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,沒(méi)有進(jìn)一步結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù),這些病原菌就可能被鑒定為普通的大腸桿菌。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),目前國(guó)內(nèi)大部份實(shí)驗(yàn)室在腸致瀉性大腸桿菌診斷方面還是以傳統(tǒng)的細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)、生化、血清鑒定為“金標(biāo)準(zhǔn)”。腸致瀉性大腸桿菌包括腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸粘附性大腸桿菌(EAEC)五種病原菌。常規(guī)的生化鑒定一般只能鑒定到大腸埃希氏菌,而且腸桿菌本身生化表現(xiàn)就相對(duì)比較活潑,很難運(yùn)用生化來(lái)區(qū)分五種病原菌;血清學(xué)診斷在致瀉性大腸桿菌中是起輔助診斷作用,且國(guó)產(chǎn)的致瀉性大腸桿菌血清存在血清因子不全,血清交叉凝集等問(wèn)題,對(duì)診斷起了干擾作用。將分子生物學(xué)和傳統(tǒng)培養(yǎng)及生化血清兩類鑒定方法有機(jī)地統(tǒng)一結(jié)合,是提高由致瀉性大腸桿菌引起的食物中毒病原菌檢驗(yàn)準(zhǔn)確率的一個(gè)有力的手段。常用的五大致瀉性大腸桿菌常規(guī) PCR檢測(cè)特異的診斷基因分別有[3-5]：ETEC(ST-耐熱腸毒素、LT-不耐熱腸毒素),EPEC(eaeA-粘附抺平因子、bf p-束狀菌毛因子),EIEC(virA-質(zhì)粒毒力基因、ipaH-侵襲性質(zhì)?？乖?,EHEC(eaeA-粘附抺平因子、stx-志賀樣毒素),EAEC(aggR-粘附聚集因子)。

下面我們對(duì)2010年兩起食物中毒事件和一起疫苗接種偶合病例病原菌檢測(cè)的案例進(jìn)行分析,說(shuō)明分子生物學(xué)技術(shù)在致瀉性大腸桿菌診斷中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的常規(guī)分離培養(yǎng) 按WS271-2007《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行培養(yǎng)分離。

1.2 生化鑒定 采用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的API 20E生化鑒定條以及廣東環(huán)凱微生物科技技術(shù)有限公司生產(chǎn)的生化微量管。

1.3 血清學(xué)診斷 采用玻片凝集,診斷血清的生產(chǎn)廠家為寧波天潤(rùn),在有效期內(nèi)使用。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR) 實(shí)時(shí)熒光診斷試劑盒廠家為上海之江生物科技有限公司,模板DNA的提取及實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

1.5 引物 引物序列依據(jù)相應(yīng)文獻(xiàn)描述[4-7],寡核苷酸由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.6 常規(guī)PCR反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)均采用20 μ L的反應(yīng)體系,除了特殊說(shuō)明,各組成成分的終濃度分別為：Ex T aq DNA聚合酶 0.5 U,dNTP 200 μ mol/L,上 游 引 物 0.4 μ mol/L,下 游 引 物 0.4 μ mol/L,DNA 模板 2 μ L 。

1.7 模板的制備 1)直接吸取細(xì)菌增菌液1.5mL,13 000r/min離心2min,棄去上清,沉淀下來(lái)的細(xì)菌加入100μ L的純水制備成菌懸液,100℃煮沸裂解10min,10 000r/min離心5min,取上清作為實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的DNA模板。2)分純的細(xì)菌菌落,直接刮取適量于300μ L的純水制備成菌懸液,100℃煮沸裂解10min,10 000r/min離心5min,取上清做為實(shí)時(shí)熒光PCR及常規(guī)PCR檢測(cè)的DNA模板。

1.8 試劑儀器 Ex Taq DNA聚合酶、dNTP購(gòu)自大連寶生物工程有限公司,瓊脂糖為BioAsia分裝品,電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6C型,讀膠儀為上海培清生產(chǎn)的JS-380,PCR擴(kuò)增儀為GStorm(英國(guó)GeneTech公司),實(shí)時(shí)熒光PCR儀為澳大利亞的Corbett公司生產(chǎn)的Rotor-gene 6000。

1.9 DNA序列的測(cè)定及比較 序列測(cè)定由上海生工完成,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序后用DNAS-tar分析軟件進(jìn)行拼接,校正后的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行核苷酸的Blast比較。

2 結(jié) 果

2.1 案例一

2.1.1 事件概況 2010年11月9日,福州某地幼稚園發(fā)生一起疑似食物中毒事件,總共25名學(xué)生出現(xiàn)腹痛、腹瀉、發(fā)燒、嘔吐等癥狀,年齡在5-6歲之間。11月16日基層CDC將從兩名患兒糞便分離的細(xì)菌培養(yǎng)皿送到我們實(shí)驗(yàn)室,其中一名患兒送檢沙門(mén)菌顯色平板和大腸桿菌顯色平板各1個(gè),另一名患兒送檢沙門(mén)菌顯色平板1個(gè)。其中從一名患兒的大腸桿菌顯色平板上檢出侵襲性的大腸埃希氏菌(EIEC)。

2.1.2 分子生物學(xué)、生化及血清檢測(cè)結(jié)果如下 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)顯示侵襲性的大腸埃希氏菌(EIEC)特異的核酸片段陽(yáng)性。常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果為EIEC特異的診斷基因(ipaH,virA)陽(yáng)性。生化實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為API20E生化鑒定條和手工微量生化管鑒定符合大腸埃希氏菌特征。(主要生化表現(xiàn)：葡萄糖⊕、乳糖 +、麥芽糖+、甘露醇 +、蔗糖-、靛基質(zhì)+、甲基紅+、VP-、枸椽酸鹽-、尿素-、苯丙氨酸-、丙二酸鹽鈉-、水楊素-、氧化酶-、硝酸鹽還原+、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶-、精氨酸雙水解酶-、賴氨酸脫羧酶+、硫化氫-、葡萄糖銨+)?，F(xiàn)有的 EIEC診斷血清不能分型。

2.1.3 結(jié)合生化及分子生物學(xué)的檢測(cè)結(jié)果判定為EIEC基因陽(yáng)性的大腸埃希氏菌。

2.2 案例二

2.2.1 事件概況 2010年11月9日漳州某地幼兒園發(fā)生一起疑似食物中毒事件。癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉,腹瀉次數(shù)最高的達(dá)10～20次/天;伴有或不伴有發(fā)熱、畏寒、頭痛、頭暈、腹痛、肢體抽搐、全身脫水等癥狀。至11月10日凌晨,類似癥狀的患兒逐漸增多,共發(fā)現(xiàn)疑似食物中毒病例共50例,其中臨床診斷病例29例。2010年11月15日基層CDC將從三份患兒糞便分離的細(xì)菌培養(yǎng)皿送到我們實(shí)驗(yàn)室：患兒1血平皿1個(gè)、沙顯培養(yǎng)平皿1個(gè),患兒2麥康凱平皿 1個(gè)、患兒3血平皿1個(gè)、山梨醇麥康凱平皿1個(gè)。其中我們從患兒3血平皿的菌落中檢出致病性的大腸埃希氏菌(EPEC)。

2.2.2 分子生物學(xué)、生化及血清檢測(cè)結(jié)果如下 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)顯示致病性的大腸埃希氏菌(EPEC)特異的核酸片段陽(yáng)性。常規(guī) PCR檢測(cè)EPEC特異的診斷基因(eaeA,bf p)陽(yáng)性。生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為API20E生化鑒定條和手工微量生化管鑒定符合大腸埃希氏菌特征(主要生化表現(xiàn)同案例二)?，F(xiàn)有的EPEC診斷血清不能未分型。

2.2.3 結(jié)合生化及分子生物學(xué)的檢測(cè)結(jié)果判定為致病性的大腸埃希氏菌(EPEC)。

2.2.4 2010年11月22日基層CDC第二次送檢部分標(biāo)本,為這起事件中的8份腹瀉患兒的肛拭子的乳糖膽鹽增菌液。肛拭的采樣時(shí)間為2010年11月10日,當(dāng)日增菌后放置于4℃冰箱,2010年11月15日對(duì)第一次增菌的增菌液進(jìn)行二次增菌后放置于4℃冰箱。二次送檢標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：實(shí)時(shí)熒光的檢測(cè)顯示8份二次增菌液的DNA提取物中有6份EPEC核酸片段陽(yáng)性。對(duì)二次增菌液的常規(guī)分離培養(yǎng)沒(méi)有分離到EPEC大腸埃希氏菌。

2.3 案例三

2.3.1 事件概況 2010年10月,我省某地發(fā)生一例乙腦疫苗接種偶合死亡病例。該病例為八月大的嬰兒,接種乙腦疫苗4d后死亡。死亡前1～2d無(wú)排便、進(jìn)食差、腹脹明顯、叩診腹部鼓音。臨終前4～5h呻吟、肚子脹明顯,死亡前 1h腹瀉 1次,呈蛋花樣,無(wú)嘔吐。從該病例的糞便標(biāo)本中分離到非典型腸致病性大腸桿菌(aEPEC)。

2.3.2 分子生物學(xué)、生化及血清檢測(cè)結(jié)果如下 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)從該病例肛拭標(biāo)本直接提取的DNA結(jié)果為EPEC-A基因陽(yáng)性,而EPEC-B基因陰性。常規(guī)PCR檢測(cè)從糞便標(biāo)本中分離純化可疑菌落的aEPEC診斷基因,結(jié)果為eaeA陽(yáng)性、bf p陰性。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)從糞便標(biāo)本中分離純化可疑病原菌的stx1和stx2基因,結(jié)果均為陰性。常規(guī)PCR擴(kuò)增的eaeA基因,進(jìn)行序列測(cè)定后在NCBI上Blast的結(jié)果均提示為大腸桿菌O157∶H7、EPEC緊密素(intimin)的eaeA基因。生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為API20E生化鑒定條和手工微量生化管鑒定符合大腸埃希氏菌特征(主要生化表現(xiàn)同案例二)?，F(xiàn)有的EPEC診斷血清不能分型。

2.3.3 綜合分子生物學(xué)、序列分析及生化和血清的檢測(cè)結(jié)果判定為不典型的腸致病性大腸桿菌(aEPEC)。

3 討 論

案例一的事件中,基層CDC采集9名患者肛拭子標(biāo)本,根據(jù)生化特征及致瀉性大腸桿菌血清不凝集的情況,結(jié)果只能判定檢出大腸埃希氏菌。目前國(guó)產(chǎn)的致瀉性大腸桿菌診斷血清存在著一些問(wèn)題,包括血清因子不全,血清交叉凝集,血清效價(jià)及血清質(zhì)控等問(wèn)題,對(duì)診斷起了干擾作用;同時(shí)由于腸桿菌本身血清、生化表現(xiàn)比較活潑,存在有新的血清型和特殊的生化反應(yīng)的可能性,根據(jù)常規(guī)的檢測(cè)方法有可能造成致瀉性大腸桿菌的漏檢。由于此次事件中,基層只送檢了兩名患兒糞便分離的細(xì)菌培養(yǎng)皿,我們只從1名患兒中檢出 EIEC,無(wú)法明確是否由EIEC引起的這起食物中毒。

案例二的疑似食物中毒事件,臨床診斷病例有29例,起先我們收到三個(gè)患兒的糞便分離培養(yǎng)物,從一例患兒中分離到EPEC病原菌,對(duì)于是否是由于該病原菌引起的食物中毒缺少說(shuō)服力。實(shí)時(shí)熒光PCR從第二次送檢的8份增菌液的DNA提取物中,檢出6份EPEC核酸片段陽(yáng)性,雖然對(duì)二次增菌液的常規(guī)分離培養(yǎng)我們沒(méi)有得到活的EPEC病原菌,但是8份二次增菌液的DNA提取物中有6份顯示EPEC核酸片段陽(yáng)性,同時(shí)結(jié)合11月15日送檢的三份患兒糞便分離的細(xì)菌培養(yǎng)皿中檢出一份EPEC病原菌陽(yáng)性,基本上可以斷定這起可疑的食物中毒事件的病原菌是EPEC。考慮二次增菌液已經(jīng)存放的時(shí)間(8d左右)和存放溫度,可能大部份病原菌已經(jīng)死亡,殘余的活病原菌數(shù)量在常規(guī)分離培養(yǎng)的檢測(cè)限下,造成分離培養(yǎng)的結(jié)果為陰性。分子診斷方法在敏感性方面要優(yōu)于常規(guī)的分離培養(yǎng),特別是實(shí)時(shí)熒光技術(shù)由于多了一條特異的探針,比常規(guī)的PCR特異性又相對(duì)地提高,是目前各種病原菌應(yīng)急檢測(cè)的首選方案。

案例三從肛拭標(biāo)本直接提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光基因檢測(cè),結(jié)果為EPEC-A基因陽(yáng)性、EPEC-B基因?yàn)殛幮?根據(jù)試劑盒提供的判斷標(biāo)準(zhǔn),提示為不典型的腸致病性大腸桿菌(aEPEC)核酸檢測(cè)陽(yáng)性。我們運(yùn)用常規(guī)PCR擴(kuò)增分純細(xì)菌的eaeA和bf p基因,結(jié)果也吻合aEPEC的病原菌特征,即eaeA基因陽(yáng)性、bf p基因陰性。eaeA序列測(cè)定后在NCBI上進(jìn)行Blast,結(jié)果提示該序列是O157∶H7、EPEC的緊密素(intimin)的eaeA基因。同時(shí)該病原菌生化鑒定的結(jié)果符合大腸埃希氏菌特征,現(xiàn)有典型的EPEC血清群都不能凝聚,綜合以上結(jié)果,鑒定該病原菌為aEPEC(未分型)。這與國(guó)際上報(bào)道的目前大部分的aEPEC血清不能歸于現(xiàn)有典型的EPEC血清型的結(jié)果也吻合[8]。在遺傳關(guān)系上,aEPEC和腸出血性大腸桿菌(EHEC或STEC)更為密切,但是不含有類志賀毒素stx1和stx2。我們運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)該stx1和stx2基因的結(jié)果也均為陰性。

在這三個(gè)案例中,若只依據(jù)生化和血清的檢測(cè)結(jié)果,病原菌都只能鑒定為普通的大腸埃希氏菌,造成錯(cuò)誤的判定。根據(jù)屬地管理原則,食物中毒的病原檢驗(yàn)任務(wù)主要由基層疾控中心承擔(dān),而大多數(shù)基層疾控中心沒(méi)有條件和技術(shù)來(lái)開(kāi)展分子診斷,如常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)等,仍然主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定來(lái)完成。基層通常是在初步生化反應(yīng)符合大腸桿菌特征后,進(jìn)行血清凝集試驗(yàn),根據(jù)血清凝集的結(jié)果來(lái)判定相應(yīng)的病原群,如果血清不凝集就只能當(dāng)做腸道的正常菌群大腸埃希氏菌來(lái)報(bào)告,可能導(dǎo)致腸致瀉性大腸桿菌檢測(cè)出現(xiàn)假陰性或者假陽(yáng)性的情況。

將分子生物學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)的分離鑒定兩類方法有機(jī)地統(tǒng)一結(jié)合,是目前提高致瀉性大腸桿菌檢驗(yàn)準(zhǔn)確率的一個(gè)有力的手段。目前較普及的分子生物學(xué)診斷技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR,由于實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性和特異性均較優(yōu)于常規(guī)PCR,且操作簡(jiǎn)單耗時(shí)短。根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本種類的不同,本方法既可以做為病原菌初篩的手段指導(dǎo)常規(guī)分離培養(yǎng)的方向(主要針對(duì)增菌液的DNA提取物),也可以對(duì)分純的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定診斷。常規(guī)PCR由于擴(kuò)增的基因和片段大小比較明確,還可以進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序分析,通?？梢詫?duì)可疑分純細(xì)菌的進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。同時(shí),分子診斷技術(shù)由于針對(duì)的是病原菌核酸片段,即使細(xì)菌已經(jīng)死亡,只要核酸沒(méi)有被完全降解,同樣能夠進(jìn)行檢測(cè);同時(shí)由于 RT-PCR的敏感性通常比常規(guī)的分離培養(yǎng)要高,當(dāng)病原菌的數(shù)量在常規(guī)分離培養(yǎng)的檢出限以下,運(yùn)用分子診斷方法仍然可以檢測(cè)出核酸片段。因此對(duì)細(xì)菌性病原菌來(lái)講將分子生物學(xué)診斷手段與常規(guī)分離鑒定方法的有機(jī)結(jié)合,是今后公共衛(wèi)生事件實(shí)驗(yàn)室調(diào)查的一個(gè)有力手段。

[1]張昕,王子軍,冉陸.2008年全國(guó)突發(fā)公共衛(wèi)生事件網(wǎng)絡(luò)報(bào)告食物中毒事件分析[J].疾病監(jiān)測(cè),2010,25(5)：406-409.

[2]蘇建忠,國(guó)文,湯芳.2007-2008年全國(guó)食物中毒發(fā)生情況分析[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,19(7)：568-570.

[3]衛(wèi)生部.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS271-2007)《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》[S].

[4]Fukushima H,T sunomori Y,and Seki R.Duplex Real-Time SYBR Green PCR Assays for Detection of 17 Species of Food-or Waterborne Pathogens in Stools[J].J Clin Microbiol,2003,41：5134-5146.

[5]Vidal R,Vidal M,Lagos R,et al.Multiplex PCR for Diagnosis of Enteric Infections Associated with DiarrheagenicEscherichia coli[J].J Clin Microbiol,2004,42：1787-1789.

[6]Wang RF,Cao WW,Cerniglia CE.Auniversal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods[J].J Appl Microbiol,1997,893：727-736.

[7]蔡軍,王金良.多重PCR和基因芯片檢驗(yàn)致病性大腸埃希菌[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,20：87-88.

[8]Hernandes RT,Elias WP,Vieira MAM,et al.An overview of atypical enteropathogenicEscherichia coli[J].FEMS Microbiol Lett,2009,297：137-149.