蛋白磷酸化/去磷酸化是指蛋白激酶(Protein kinase,PK)催化蛋白質(zhì)的含羥基氨基酸(絲/蘇和酪)的側(cè)鏈羥基形成磷酸酯,和蛋白質(zhì)磷酸酯酶(Protein phosphatase,PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯鍵水解而去磷酸化的過程。蛋白磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價修飾方式之一,這一可逆過程受蛋白激酶和磷酸酶的協(xié)同作用控制,細胞內(nèi)任何一種蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的兩種酶活性之間的平衡決定的。蛋白磷酸化/去磷酸化是細胞信號傳遞過程中普遍存在的現(xiàn)象,在調(diào)節(jié)信號傳遞過程中起重要作用。在剛地弓形蟲入侵和寄生于宿主細胞的過程中,不但其自身蛋白發(fā)生磷酸化/去磷酸化,而且其所入侵、寄生的宿主細胞的蛋白也會廣泛地發(fā)生磷酸化/去磷酸化。被弓形蟲感染的宿主細胞信號通路出現(xiàn)大規(guī)模的改變,主要表現(xiàn)在以下幾方面：弓形蟲分泌蛋白調(diào)控宿主細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo);弓形蟲調(diào)節(jié)宿主的天然免疫和保護性免疫、抗凋亡反應(yīng)、細胞周期變化、鈣離子等相關(guān)的細胞信號通路。以上細胞信號通路的變化與弓形蟲或宿主細胞的蛋白發(fā)生磷酸化/去磷酸化密切相關(guān),蛋白磷酸化/去磷酸化是弓形蟲與宿主細胞間相互作用的關(guān)鍵事件。

1 在剛地弓形蟲入侵、寄生過程中蟲體蛋白的磷酸化

滑動相關(guān)蛋白(gliding-associated protein,GAP)：弓形蟲的運動是肌球蛋白XIV復(fù)合體驅(qū)動的,這個復(fù)合體由肌球蛋白XIV重鏈(XIV heavy chain,MyoA)、輕鏈(myosin light chain,MLC1)、GAP45和GAP50(一種膜錨定復(fù)合物,為剛地弓形蟲內(nèi)膜復(fù)合體的必備膜蛋白)組成,肌動蛋白聚合是寄生蟲活動力與入侵宿主細胞過程的中心環(huán)節(jié)。MyoA,MLC1,和GAP45首先結(jié)合在一個可溶性的復(fù)合體中,然后再與GAP50結(jié)合,肌球蛋白XIV復(fù)合體的所有蛋白都是剛地弓形蟲存活所必須的。研究證明這個驅(qū)動復(fù)合體的最終組合成功取決于GAP45的磷酸化。這個蛋白的磷酸化發(fā)生在多個氨基酸殘基上,如Ser(163)和Ser(167),這兩個氨基酸的磷酸化控制著肌球蛋白XIV驅(qū)動復(fù)合體組合的最終步驟[1]

棒狀體蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)：弓形蟲的侵襲力與毒力有關(guān),ROP家族被認為是決定弓形蟲毒力的蛋白,由棒狀體分泌,在弓形蟲入侵宿主細胞時注入細胞質(zhì)內(nèi)。成熟、加工過的跨膜蛋白ROP4定位于弓形蟲棒狀體上,分泌的 ROP4與泡膜有關(guān),且在受感染的細胞中發(fā)生磷酸化。ROP2也有類似的結(jié)果。對 ROP4進一步分析表明,它在多個位點發(fā)生磷酸化,被感染細胞內(nèi)的 ROP4和ROP2蛋白家族成員被定位和轉(zhuǎn)錄后,在泡膜功能中發(fā)揮重要作用[2]。N-端關(guān)鍵氨基酸殘基的自磷酸化導(dǎo)致ROP18活化,ROP18活化又使 ROP2和ROP8磷酸化,當(dāng)磷酸化的N-端解除自我抑制后,ROP18被最大程度地激活。這種調(diào)節(jié)ROP激酶活性的的方式代表了弓形蟲的毒力[3]。弓形蟲ROP16在入侵時被注入宿主細胞胞質(zhì),然后到達細胞核,影響了不同的信號通路,如在免疫反應(yīng)啟動過程中的關(guān)鍵分子STAT3/6及其下游的宿主細胞因子IL-12等信號通路,并與不同毒力株引起的病理變化有關(guān)[4]。

致密顆?？乖?dense granules antigen,GRA)：致密顆粒蛋白是由剛地弓形蟲致密顆粒細胞器分泌的一類具有免疫活性的蛋白質(zhì),約有13種包括GRA1-GRA9,三磷酸核苷水解酶的同工酶NTPaseI和NTPaseⅡ,以及兩個蛋白酶抑制劑。GRA7含有疏水和跨膜結(jié)構(gòu),可直接嵌入納蟲泡膜,只有在宿主細胞中才能被磷酸化,入侵10min之內(nèi),GRA7存在于宿主胞質(zhì)中含有棒狀體蛋白的(包括GRA1和GRA3)繩索狀結(jié)構(gòu)上,和棒狀體蛋白 ROP2和ROP4結(jié)合,參與納蟲泡的形成和保護蟲體在細胞內(nèi)的存活與增殖[5]。

真核起始因子2(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)：弓形蟲eIF2α的磷酸化是對環(huán)境壓力的保守性反應(yīng),其磷酸化位點的突變導(dǎo)致該蛋白不被磷酸化,而使具有該突變位點的弓形蟲不能適應(yīng)細胞外的生存,存活力大大下降。而且該突變蟲體在體內(nèi)引起急性弓形蟲病的時間也顯著延長。弓形蟲在尋找新宿主細胞的過程中需要抵抗外環(huán)境的壓力,弓形蟲eIF2α被磷酸化,從而改善細胞外環(huán)境壓力,在細胞裂解周期中起著重要的作用,在緩殖子體內(nèi),弓形蟲IF2α保持磷酸化狀態(tài)[6-7]。

2 在弓形蟲入侵、寄生過程中宿主蛋白的磷酸化

2.1 弓形蟲ROPs直接使宿主細胞蛋白磷酸化細胞免疫相關(guān)GTP酶(immunity-related GTPase,IRG)磷酸化：弓形蟲毒力因子ROP18激酶的靶標是一種由IFN誘導(dǎo)的IRG家族蛋白,也是小鼠抵抗弓形蟲弱毒株的有效因子。IRG蛋白的GTP結(jié)合位點的活化構(gòu)象Switch I區(qū)域是抗弓形蟲的關(guān)鍵位點,弓形蟲強毒株的ROP18激酶能使IRG蛋白磷酸化(將IRGa6的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的兩個Thr殘基磷酸化),從而使IRG酶失活,抑制其在納蟲泡膜上的聚集和降解納蟲泡最終清除弓形蟲的作用[8]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)磷酸化：ROP16是弓形蟲關(guān)鍵的毒力因子及宿主細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,ROP16具有酪氨酸激酶活性,通過將STAT6的關(guān)鍵酪氨酸 Tyr(641)磷酸化而誘導(dǎo)STAT6持續(xù)活化和快速活化(1分鐘以內(nèi)),弓形蟲感染細胞免疫共沉淀的實驗證明ROP16與STAT6可相互結(jié)合,而且STAT6是ROP16的直接底物[9]。弓形蟲入侵細胞伴隨著快速和持續(xù)的宿主細胞STAT3的活化,宿主被弓形蟲感染后天然免疫系統(tǒng)依賴于STAT3產(chǎn)生促炎癥細胞因子。ROP16缺失的I型弓形蟲感染的巨噬細胞體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)野生型弓形蟲誘導(dǎo)的STAT3的活化,但是IL6及IL-12 P40的表達卻顯著升高,II型蟲株不能抑制免疫反應(yīng)是因為ROP16的功能缺失。在哺乳動物細胞內(nèi)過表達的ROP16導(dǎo)致STAT3磷酸化及STAT3-依賴啟動子的強活化,ROP16與STAT3結(jié)合直接誘導(dǎo)這個轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化[10]。

2.2 受弓形蟲感染后宿主細胞蛋白的磷酸化反應(yīng)

2.2.1 調(diào)節(jié)宿主的天然免疫和保護性免疫 ①促炎癥反應(yīng)細胞因子的活化：參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子都受NF-κ B的調(diào)控,被弓形蟲感染的哺乳動物細胞可導(dǎo)致NF-κ B下調(diào)和I-κ B kinase(IKK)活化而使 I-κ Bα磷酸化。NF-κ B級聯(lián)信號的終止與p65/RelA磷酸化的減少有關(guān),而且磷酸化的p65/RelA可使NF-κ B進入細胞核與DNA結(jié)合,因此在 NF-κ B級聯(lián)信號中,磷酸化的p65/RelA有可能被病原體破壞而導(dǎo)致 NF-κ B下調(diào)。與NF-κ B激活一致的是,弓形蟲感染促進I-κ B的磷酸化,磷酸化的I-κ B聚集在納蟲泡膜上,這個現(xiàn)象表明有弓形蟲本身的成分參與調(diào)節(jié)宿主NF-κ B信號通路以引起弓形蟲感染的免疫反應(yīng)過程[11]。

胞內(nèi)弓形蟲可使小鼠巨噬細胞(Mphi)中MAPK迅速激活,弓形蟲引發(fā)的IL-12的生成依賴于有絲蛋白原活化蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase 38,MAPK p38)。合成的p38催化位點抑制劑阻斷了速殖子誘導(dǎo)的p38(MAPK磷酸化,說明弓形蟲胞內(nèi)感染可觸發(fā)p38 MAPK自體磷酸化[12]。

②Toll樣受體(T oll like receptor,TLR)相關(guān)信號通路的活化：TLRs是生物的一種模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR),它主要通過識別病原相關(guān)分子來啟動免疫反應(yīng),可激活下游一系列銜接蛋白和信號分子并最終活化核因子NF-κ B,啟動炎癥分子、細胞因子及共刺激分子的表達。而MyD88是Toll受體信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子,是第一個被鑒定的含 TLR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白分子,在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。T LR與配體的結(jié)合可加強其本身二聚體化及與MyD88蛋白的結(jié)合。MyD88的N端片段可與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(IL-1receptor accessory protein kinase,IRAK)相互作用,促使IRAK的自體磷酸化。TLR與配體結(jié)合后還可通過MAPK的Jun N端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)激活活化蛋白1(activator protein-1,AP-1)轉(zhuǎn)錄因子家族(Jun和Fos)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和AP-1為產(chǎn)生細胞因子所必需的蛋白[13-14]。

MD-2是一種分泌蛋白,存在于TLR4細胞外區(qū)域,可以穩(wěn)定 TLR4二聚體并增強其功能。在LPS刺激的反應(yīng)中,CD14和 TLR4/MD-2的聯(lián)合作用可以增強ERK、JNK、p38MAP激酶的磷酸化,促使TNF-α(人外周血單核細胞腫瘤壞死因子)高度表達[15]。

2.2.2 調(diào)控宿主細胞抗凋亡反應(yīng)[16-17]和細胞周期性[18]：弓形蟲在宿主體內(nèi)可引起持續(xù)感染,其在細胞內(nèi)生存的能力很大程度上取決于自身阻斷宿主細胞凋亡信號通路的能力,剛地弓形蟲調(diào)控的幾種細胞信號通路包括 NF-κ B和 JNK。宿主轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B在剛地弓形蟲介導(dǎo)的抗凋亡中起著關(guān)鍵的作用,因為在缺少NF-κ B亞基p65(RelA)的細胞中不出現(xiàn)凋亡抑制的現(xiàn)象。在用凋亡刺激因子 UV和TNF-α處理時出現(xiàn)明顯的JNK活化異常,在Hela細胞中,弓形蟲感染可抑制JNK磷酸化,但并不影響JNK激酶的活性[19]。另外,在弓形蟲感染的宿主細胞中,PI3K(phosphoinositide 3-kinase)信號通路及其下游的效應(yīng)因子蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)被活化,并在抗凋亡作用方面起著重要角色,PI3K的抑制劑wortmannin和LY294002可以阻斷剛地弓形蟲誘導(dǎo)的PKB磷酸化[20]。

絲/蘇氨酸激酶mTOR(mammalian-target-ofrapamycin)是一種調(diào)節(jié)細胞合成、代謝、生長及增殖的重要的因子。弓形蟲侵入各種細胞后會快速誘導(dǎo)mTOR活化,同時被核糖體蛋白磷酸化所控制。然而與mTOR作用相關(guān)的mTOR底物4E-BP1和S6K1的磷酸化卻檢測不到,盡管S6K1磷酸化的程度很低,但感染細胞依然會在胰島素的誘導(dǎo)下使S6K1和4E-BP1產(chǎn)生磷酸化。宿主細胞的mTOR位于圍繞剛地弓形蟲納蟲泡的小泡上,雖然不能使4E-BP1和S6K1磷酸化,但宿主細胞內(nèi)的剛地弓形蟲以一種mTOR-依賴的方式和速度來激活宿主細胞周期程序[18]。

2.2.3 調(diào)控宿主細胞鈣離子信號通路,從而調(diào)控弓形蟲運動、入侵、和逸出細胞及宿主細胞的免疫等過程[21-22]鈣離子在剛地弓形蟲的生活史中起著重要的作用包括免疫、運動、入侵、和逸出細胞等過程。在弓形蟲入侵宿主過程中自身的滑動結(jié)構(gòu)組分(glideosome apparatus components)被磷酸化。弓形蟲鈣調(diào)蛋白樣結(jié)構(gòu)域蛋白激酶異構(gòu)體3(T.gondiicalmodulin-like domain protein kinase isoform 3,TgCDPKif3)酶觸反應(yīng)的賴氨酸殘基被丙氨酸代替后,磷酸化也被消除,TgCDPKif3將組蛋白 II(AS)作為一種代表性的底物以Ca2+-依賴的方式在高Ca2+濃度下使其磷酸化,在體內(nèi),TgCDPKif3能夠?qū)⒐蜗x醛縮酶 1(T gALD1)磷酸化,TgCDPKif3通過將滑動復(fù)合體磷酸化參與弓形蟲的運動[23]。

然而宿主細胞的鈣離子是弓形蟲誘導(dǎo)MAPK、LPS(lipopolysaccharide)及CpG的活化,IL-12合成必需的,用弓形蟲處理或LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)的鈣離子增強了MAPK的磷酸化,由弓形蟲誘導(dǎo)的并且依賴鈣離子的PKC?和PKC?的急性活化反應(yīng)是宿主的MAPK活化及IL-12產(chǎn)生所必需的,因而鈣離子和PKC都是剛地弓形蟲感染引起宿主細胞產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素[21]。

綜上所述,蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化這個可逆的過程保證了弓形蟲與宿主細胞對彼此間細胞信號的持續(xù)反應(yīng),在剛地弓形蟲入侵和寄生于宿主的過程中,通過自身蛋白磷酸化和去磷酸化以及誘導(dǎo)宿主細胞蛋白的磷酸化/去磷酸化,對宿主細胞進行精細的整體的調(diào)控,在誘發(fā)及抑制宿主免疫反應(yīng)之間保持一個精細的平衡,保證弓形蟲在宿主細胞內(nèi)安全地生存增殖,并有機會傳播給終末宿主[24]。在宿主細胞被感染的過程中,宿主細胞信號傳遞發(fā)生廣泛的變化,包括細胞信號蛋白表達水平的改變及蛋白的磷酸化和去磷酸化。這些細胞信號的調(diào)控在弓形蟲入侵、寄生及與弓形蟲-宿主相互關(guān)系中起著非常重要的作用。

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