畜牧獸醫(yī)科技文摘

鵝細小病毒基因組結構特征研究進展/朱海俠（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所），萬春和，黃瑜//中國動物傳染病學報.-2011,19(1).-81～82

鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)屬細小病毒科,細小病毒屬,由我國學者方定一1956年首次分離報道。GPV基因組約5 Kb,由左右2個完整的開放閱讀框(open reading frame,ORF)組成:LORF(left ORF)和RORF(right ORF)。LORF編碼非結構蛋白(nonstructural protein,NS)NS1和NS2,RORF編碼VP1、VP2和VP3三種結構蛋白。本文針對近年來鵝細小病毒基因組結構特征的研究進展進行了綜述。

柔嫩艾美耳球蟲抗藥性相關基因M20的克隆與表達/程軍（上海師范大學生命與環(huán)境科學學院），董輝，郭濤等//中國動物傳染病學報.-2001,19(1)-62～67

利用前期構建的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株與各自母株之間的抑制性消減文庫而獲得的ESTs序列,選擇其中一個差異表達的EST序列(克隆號為M20),采用RACE技術,以柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊cDNA為模板,擴增獲得了該基因的全長cDNA序列,命名為M20,該基因全長847 bp,包括一個525 bp的開放閱讀框,編碼174個氨基酸,預測理論分子量約為19 ku。實時熒光定量PCR結果顯示,該基因在敏感株中表達量高于地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株;在不同發(fā)育階段中,未孢子化卵囊表達量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子階段蟲體。將該基因克隆于原核表達質粒pET28b中,構建重組質粒pET28b-M20,轉化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導表達獲得了重組蛋白,分子量約約為23 ku,該蛋白以包涵體形式存在,在IPTG誘導8h后表達穩(wěn)定,Western blot檢測表明,其具有較好的免疫原性。

羊種布氏菌體外藥物敏感性分析/姜海(中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所),崔步云,趙鴻雁等//中國人獸共患病學報.-2011,27(4).-325～326，330

目的了解羊種布氏菌對常用抗生索的耐藥情況及耐藥機制。方法用微量稀釋法對國內(nèi)分離的69株羊種布氏菌進行12種抗生素(阿奇霉素、克拉霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、利福平、頭孢曲松、復方新諾明、鏈霉素)的耐藥檢測。結果除了阿奇霉素和克拉霉素外,所有羊種布氏菌對另外10種抗生素均敏感。所有菌株23SrRNA都具有單核苷酸多態(tài)性2632 T/C。結論 23SrRNA轉肽酶中心點突變是羊種布氏菌耐大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的機制之一。盡管布氏菌耐藥尚未對布病防控構成威脅,但還需開展耐利福平監(jiān)測工作。

志賀氏菌病發(fā)病機制的研究進展/康靜靜（河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院），楊玉榮，梁宏德//中國農(nóng)業(yè)科學.-2011,44(9).-1939～1944

志賀氏菌也稱痢疾桿菌,屬于革蘭氏陰性細胞內(nèi)致病菌,主要侵害結腸,引發(fā)炎癥并形成潰瘍,可引起頻繁的粘液性血性腹瀉,兒童和幼齡動物有較高的感染率和死亡率。目前志賀氏菌病的臨床治療很困難,對志賀氏菌病發(fā)病機制的研究可為臨床治療提供理論依據(jù),本文從志賀氏菌的胞內(nèi)入侵機制、分子機制和免疫機制等方面概述志賀氏菌病發(fā)病機制的研究進展。

抗犬Ⅰ型腺病毒單克隆抗體的制備及生物學特性鑒定/李曉葉(吉林大學畜牧獸醫(yī)學院),劉穎,藍田豐等//中國農(nóng)學通報.-2011,27(11).-31～34

為制備抗犬I型腺病毒單克隆抗體,將犬I型腺病毒(CAV-I)細胞培養(yǎng)液飽和硫酸銨沉淀,差速離心濃縮,氯化銫密度梯度離心的方法純化后免疫BALB/c小鼠,三免后效價過1:10000即可取脾細胞與SP2/0細胞在聚乙二醇(PEG)作用下融合,通過間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞株,有限稀釋法亞克隆,制備單克隆抗體,并對制備完成的單克隆抗體進行生物學特性鑒定。獲得2株能穩(wěn)定分泌抗CAV-I的單克隆抗體雜交瘤細胞,命名為C8、E9,經(jīng)鑒定其亞型分別為IgG1和IgG2a。間接ELISA檢測效價,2株單抗細胞上清液效價為1:3200～1:6400,腹水效價為1:25600～1:51200。該單克隆抗體與CDV、FPV、FCV病毒均無交叉反應。實驗成功制備了抗CAV-I單克隆抗體,為進一步建立相關診斷方法奠定了基礎。

犬細小病毒VP2基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達與檢測/畢聰明（遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院），費東亮，陳強等//中國農(nóng)學通報.-2011,27(7).-352～355

為表達犬細小病毒VP2蛋白(CPVVP2),用于犬細小病毒病的診斷、疫苗研制和VP2蛋白功能研究,根據(jù)基因庫已發(fā)表犬細小病毒序列設計合成了VP2基因的1對特異引物,以細小病毒感染的犬糞樣品中提取的總DNA為模板,進行PCR擴增,把擴增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體進行測序、鑒定。將克隆的VP2基因片段克隆至原核表達載體PGEX-6P-1,再將構建成功的原核表達質粒載體PGEX-6P-VP2轉化至大腸桿菌BL21中,進行鑒定、測序、表達。結果表明,克隆的VP2基因片段全長1755bp,與6個VP2基因序列的同源性為98.7%～99.7%。Western-blotting分析顯示,表達產(chǎn)物約為90kD的融合蛋白,可被犬細小病毒陽性血清所識別,具有良好的反應原性。

雞傳染性支氣管炎病毒HN104株的鑒定及S1基因的分子特征/劉文杰(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院),王忠田,李新生等//中國農(nóng)學通報.-2001,27(7).-343～347

2010年4月從河南省某疑似患雞傳染性支氣管炎雞場中分離到一株病毒。通過SPF雞胚致侏儒實驗,雞紅細胞凝集試驗,干擾新城疫病毒增殖試驗和RT-PCR試驗確認該病毒為一變異的雞傳染性支氣管炎病毒。該病毒尿囊液凝集雞紅細胞的HA價為0,經(jīng)胰酶處理后為27;EID50(雞胚半數(shù)感染量)為10-5.5/0.1mL;能夠顯著干擾雞新城疫病毒LaSota株在雞胚中的增殖;動物回歸試驗結果顯示該病毒可致SPF雛雞出現(xiàn)腎臟腫大,呈花斑腎。其S1基因全長為1617bp,經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)與雞傳染性支氣管炎疫苗Massachusetts株、T株、4/91株親緣關系較遠低于78%。

綿羊痘病毒RPO30基因的克隆及序列分析/趙志荀(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院),吳國華,顏新敏等//中國農(nóng)學通報.-2011,27(7).-304～308

選擇羊痘病毒RNA聚合酶RPO30進行分析,為進行RNAi羊痘病毒研究,進行目的基因的初步篩選。PCR擴增RPO30基因,連入pMD18-T simple載體并轉化DH5a大腸桿菌。經(jīng)藍白斑篩選挑選白斑制備質粒,經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定。結果成功克隆了RPO30基因,克隆的SSPV RPO30基因ORF為585bp,編碼193個氨基酸,閱讀框內(nèi)有一個HindIII酶切位點,測序結果與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中不同痘病毒毒株之間同源性存在著明顯區(qū)別。進一步經(jīng)過生物學軟件分析表明RPO30蛋白質氨基酸4—12、18—26、50—61、68—92,176—190位之間區(qū)域形成活性中心的可能性較大,選擇這些區(qū)域進行作用可能會造成該基因產(chǎn)物酶的失活,從而高效抑制病毒的復制。

寧波市狂犬病病毒NB0901株核蛋白基因的序列分析/易波(寧波市疾病預防控制中心傳染病防制所);倪紅霞;方挺等//中國媒介生物學及控制雜志.-2011,22(2).-148～150

目的通過RT-PCR方法對2009年寧波市狂犬病病毒分離株(NB0901)的N基因擴增并測序,了解寧波地區(qū)狂犬病病毒的流行特點。方法運用RT-PCR方法和序列測定方法獲得NB0901株的N基因序列,并在核苷酸和氨基酸水平與疫苗株(3aG和CNT-1)進行同源性比較,同時進行遺傳進化分析。結果狂犬病病毒NB0901株與疫苗株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別在86.6%～90.1%和95.5%～98.8%之間。NB0901株N蛋白的抗原表位與疫苗株相比后發(fā)現(xiàn)在NⅠ和NⅡ抗原表位存在突變。而在Th細胞表位上,NB0901株與CNT-1株完全一致,與3aG株相比變異較大。進化結果表明NB0901株屬于狂犬病病毒Ⅰ群中的A亞型。結論狂犬病病毒NB0901株和當前疫苗株雖同屬于Ⅰ群,但是與疫苗株相比存在差異,從氨基酸序列水平上分析,CNT-1株較3aG株更能有效保護流行毒株感染。

豬腦心肌炎病毒NJ08株基因組序列測定與分析/白娟(南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室)蔣康富,李玉峰等//中國預防獸醫(yī)學報.-2011,33(5).-402～404

為測定豬源腦心肌炎病毒(EMCV)NJ08分離株全基因序列,本研究應用RT-PCR方法分5個基因片段擴增NJ08分離株的基因組,同時應用3'-RACE和5'-RACE技術擴增3'-UTR和5'-UTR,分別克隆于pMD18-T載體中進行測序,獲得EMCVNJ08株全基因組cDNA序列,并將全基因組及其推導的氨基酸序列與GenBank中登錄的國內(nèi)外參考病毒株進行同源性比較及系統(tǒng)進化分析。結果表明:EMCVNJ08分離株基因組全長7724bp;屬于Ia亞群;與GXLC、GX0602、BJC3、HB1等國內(nèi)分離株以及BEL-2887A、CBNU、K3、K11、EMCV-R、PV21等國外分離株同源性達99%以上;EMCV流行株的非結構蛋白中3D最為保守,2A變異最大,結構蛋白中VP2最為保守,VP1變異最大。本研究豐富了我國EMCV分子流行病學資料。

我國部分地區(qū)蛋雞ALV-J分離株gp85基因遺傳進化分析/潘偉(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室),高玉龍,劉超男等//中國預防獸醫(yī)學報.-2011,33(5).-399～401,414

為了解我國蛋雞J亞型白血病病毒(ALV-J)株來源及其遺傳進化關系,本研究對2009年從我國6個省區(qū)蛋雞場分離到的19株ALV-J的gp85基因進行克隆和測序,并與11個ALV-J參考株gp85基因作了比較分析。結果表明:19個ALV-J分離株的gp85基因長度為894bp～924bp不等,分別編碼298～308個氨基酸;各病毒株間gp85推導氨基酸的同源性為71.3%～100%。遺傳進化分析表明,目前我國蛋雞ALV-J分離株來源復雜,其中13個分離株與英國原型株HPRS-103、國內(nèi)麻黃肉雞株SCAU-0901親緣關系較近;3個分離株與美國株ADOL-7501及國內(nèi)白羽肉雞株HN0001處在同一大的分支;而另外3個分離株則各自形成獨立的分支,表明其gp85基因發(fā)生了較大變異。本研究表明,19個分離株與國內(nèi)早期肉雞分離株親緣關系較遠,提示我國當前蛋雞ALV-J株可能并非源自國內(nèi)早期肉雞ALV-J株,其來源有待進一步研究。

牛腸道病毒的分離鑒定/李英利(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/大動物病研究室),常繼濤,于力//中國預防獸醫(yī)學報.-2011,33(5).-388～390

本研究從內(nèi)蒙古某奶牛場的犢牛糞便樣品中分離的一株牛腸道病毒(BEV),命名為BHM26,通過電鏡觀察顯示和分子生物學鑒定,發(fā)現(xiàn)病毒粒子在細胞漿中呈結晶狀排列,單一病毒粒子呈典型小RNA病毒粒子形態(tài),直徑為25nm～30nm,無囊膜;病毒的部分3D蛋白編碼區(qū)和全長3'UTR區(qū)段的1026bpDNA片段的RT-PCR擴增和序列分析表明,其核苷酸序列與GenBank登錄的參考病毒株核苷酸序列同源性為71.9%～87%,其中與BEVWye-3A株同源性最高,為87%。分析表明中國BEV分離株與國外參考毒株具有較大差異。

抗豬偽狂犬病病毒gH抗體的制備及gH在感染細胞中表達分析/劉慶偉(中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室)，邱亞峰，王曉杜等//中國預防獸醫(yī)學報.-2011,33(5).-383～387

為檢測偽狂犬病病毒(PRV)在體外細胞中糖蛋白H(gH)的表達情況,本研究構建原核表達重組質粒pET-gHN660,并在大腸桿菌中誘導表達重組蛋白,純化的gH重組蛋白免疫實驗動物制備抗PRVgH抗體,經(jīng)westernblot和IFA檢測到病毒感染細胞中gH蛋白的表達,病毒感染細胞后表達的gH蛋白大小為95ku,定位于細胞漿中,gH蛋白在病毒感染細胞4h可以檢出,隨PRV的復制gH蛋白表達增加,gH蛋白可以作為PRV復制的指示蛋白。本研究利用制備的抗體分析感染細胞中gH蛋白的表達情況,初步探討感染細胞中PRV的復制,為PRV和宿主相互作用的研究奠定基礎。

豬白細胞介素-2在BHK-21細胞中表達及其活性分析/王大偉(石河子大學動物科技學院),喬軍,張輝等//中國預防獸醫(yī)學報.-2011,33(5).-378～382

為鑒定BHK-21細胞中穩(wěn)定表達豬白細胞介素-2(PoIL-2)的活性,本研究利用RT-PCR技術從豬的淋巴細胞中克隆PoIL-2基因,將其連接于pcDNA3.1載體中,并轉染BHK-21細胞。經(jīng)過G418篩選及RT-PCR鑒定,獲得穩(wěn)定表達PoIL-2基因的BHK-21細胞系。采用實時定量PCR及ELISA測定PoIL-2在BHK-21細胞內(nèi)的表達,同時以淋巴細胞增殖試驗(MTT)檢測PoIL-2蛋白活性。試驗結果表明穩(wěn)定整合PoIL-2基因的BHK-21細胞系其PoIL-2mRNA的轉錄效率是陰性對照組1.43倍,蛋白表達量是陰性對照組1.29倍。MTT試驗表明真核表達的PoIL-2促淋巴細胞增殖活性與陰性對照組相比差異極顯著(p<0.01),表明BHK-21細胞表達的PoIL-2具有良好的生物學活性。本研究為開發(fā)新型基因工程疫苗佐劑和抗病毒制劑奠定了基礎。

狂犬病病毒糖蛋白在Bac-to-bac桿狀病毒系統(tǒng)中的表達及應用/范曉娟(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室),李剛,李偉等//中國預防獸醫(yī)學報.-2011,33(5).-366～369

為表達狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G),本研究通過RTPCR方法克隆RVFluryLEP病毒株G基因,將其克隆至質粒pFastBacHTα中,重組質粒pFastBac-RV-G轉化DH10Bac感受態(tài)細胞,經(jīng)同源重組獲得重組桿狀病毒穿梭質粒Bacmid-RV-G,將其轉染昆蟲細胞sf21獲得含有G基因的重組桿狀病毒。采用SDS-PAGE和westernblot對重組蛋白進行鑒定及抗原性分析,以重組G蛋白作為包被抗原的ELISA檢測36份犬血清樣品。結果表明,在Bac-to-bac桿狀病毒系統(tǒng)中表達的RVG蛋白能與histag單克隆抗體及RV陽性血清發(fā)生特異性反應,其相對分子量為60ku;與以RV為包被抗原的商品化ELISA試劑盒相比,以重組RVG蛋白為抗原建立的間接ELISA的敏感性、特異性和符合率分別為80%、81.8%和80.6%,表明桿狀病毒系統(tǒng)表達的RVG蛋白是檢測RV抗體的理想抗原蛋白,作為一種亞單位疫苗具有潛在的應用前景。

穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶PK-15細胞系的建立/黃俊華(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室)，賀番，孫元等//中國預防獸醫(yī)學報.-2001,33(5).-358～361

為構建穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶(RNAP)的豬腎細胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coliBL21(DE3)細菌基因組為模板擴增T7RNAP基因,將其克隆到逆轉錄病毒載體pLXSN中,構建重組質粒pLXSN-T7。采用脂質體將pLXSN-T7轉染至PT67細胞中,經(jīng)G418篩選培養(yǎng)獲得重組逆轉錄病毒rMLV-T7,將其接種于PK-15細胞進行G418加壓篩選和純化;應用PCR、間接免疫熒光試驗及T7啟動子控制下的紅色熒光蛋白的重組表達質粒(pET-RED)進行瞬時表達,檢測T7RNAP的表達及活性,結果表明篩選所得的細胞系PK/T7的不同代次均具有轉錄活性。本研究建立穩(wěn)定表達T7RNAP的細胞系PK/T7,為實現(xiàn)細胞內(nèi)T7啟動的轉錄和豬源RNA病毒等的反向遺傳操作提供了有效的方法。

兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60與兔肝臟細胞中相互作用蛋白的初步篩選/穆亞芳(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/實驗動物研究室)，劉家森，郭東春等//中國預防獸醫(yī)學報.-2001,33(5).-354～357

為鑒定兔出血癥病毒(RHDV)在感染兔肝臟過程中與肝細胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文庫構建技術構建了兔肝臟細胞的真核表達cDNA重組質粒文庫,將其轉染SP2/0細胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選表達兔肝細胞蛋白的陽性SP2/0細胞。以RHDV-VP60蛋白作為固相包被抗原,經(jīng)篩選,獲得能夠與VP60蛋白相互結合的表達性陽性SP2/0細胞克隆。測序表明26個克隆與兔的一些功能性蛋白有較高的同源性,其中包括代謝酶類13個、免疫信號通路受體蛋白5個以及其他細胞膜蛋白等。本研究鑒定的與RHDVVP60具有結合性的細胞蛋白為RHDV感染機制的研究奠定了基礎。

雞傳染性支氣管炎病毒ck/CH/LHB/100801株的分離鑒定及分子特征研究/馬會杰(東北農(nóng)業(yè)大學),劉孝珍,韓宗璽等//中國預防獸醫(yī)學報.-2011,33(5).-348～353

本研究于2010年8月從河北省某雞場雞群中分離一株病毒,通過對分離株進行電子顯微鏡觀察、雞胚致病性試驗、血凝特性試驗等生物學特性及雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)核蛋白基因RT-PCR方法鑒定,結果表明分離株為IBV,命名為ck/CH/LHB/100801。根據(jù)GenBank中登錄的IBV基因組序列,設計擴增病毒全基因組的19對引物,并擴增病毒基因組,采用3`-RACE和5`-RACE技術,擴增得到該病毒全部基因組序列。通過與已發(fā)表的參考病毒株全基因組序列比較表明,該分離株基因組全長為27675bp,共有10個開放閱讀框,其基因排序為:5'-cap-Replicase-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-poly(A)-3',纖突蛋白裂解位點為534RRFRR538。序列分析表明ck/CH/LHB/100801與臺灣分離株TW2296/95的結構蛋白序列相似性高達99.8%,進化親緣關系最近,推測兩分離株間可能具有相同的進化來源。

禽源U6啟動子介導雞馬立克氏病病毒gI、gE基因特異siRNA的篩選及干擾活性鑒定H5亞型禽流感疫苗變異候選株的構建/張文俊(揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室),薛濤,吳小偉等//中國家禽.-2011,33(8).-14～18

本文就2008年在江蘇某雞場分離到的一株發(fā)生抗原變異的H5N1亞型禽流感病毒A/chicken/Huadong/4/2008(wt-DT株)開展如下研究:利用反向遺傳技術,刪除wt-DT株病毒血凝素(HA)基因多堿性氨基酸序列,使之成為低致病特征,再與wt-DT株的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因組合,結合雞胚高產(chǎn)病毒PR8株的6個內(nèi)部片段骨架,構建針對此種變異H5亞型禽流感的疫苗株,結果成功拯救出重組病毒rH5N1/PR8。病毒在雞胚和MDCK細胞上均具有較好的繁殖能力,相對于wt-DT株,rH5N1/PR8在MDCK細胞上的繁殖能力明顯提高。rH5N1/PR8對SPF雞和雞胚無致病性,在雞體內(nèi)的免疫保護效果良好,符合疫苗候選株的標準。

泊洛沙姆—辛酸法對雞卵黃脫脂條件的研究/張倫(河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院),高軒,李明義//中國動物檢疫.-2011,28(3).-49～51

本文就泊洛沙姆濃度、辛酸濃度、泊洛沙姆沉淀法沉淀離心條件對泊洛沙姆-辛酸法對雞卵黃脫脂的影響進行了探討。實驗結果表明:泊洛沙姆濃度、辛酸濃度分別對卵黃脫脂存在不同程度影響,卵黃稀釋液沉淀離心條件對卵黃脫脂影響不大。蛋黃稀釋液不經(jīng)離心直接紗布過濾,辛酸濃度為0.2%,泊洛沙姆濃度分別為0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的7個處理中,以1.2%濃度的提取效果最好;泊洛沙姆濃度為1.2%,辛酸濃度為0.2%,蛋黃稀釋液經(jīng)離心處理和紗布過濾處理對卵黃脫脂影響不大;泊洛沙姆濃度為1.2%,蛋黃稀釋液紗布過濾處理,辛酸濃度分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的6個處理中,以0.2%濃度的提取效果最好。