邸 磊,王治元,王 志,李 寧,王開金

(安徽大學生命科學學院安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室,安徽 合肥 230039)

益智仁為姜科 (Zingiberaceae)山姜屬 (AlpiniaRoxb.)植物益智(A.oxyphyllaM iq.)的干燥成熟果實,為中國四大南藥之一,主產(chǎn)于海南和廣東等地,為常用中藥材。益智仁具有溫脾止瀉攝唾和暖腎固精縮尿等功效,臨床多用于脾腎虛寒不固所致諸癥[1]。從益智仁中已分離出二芳基庚烷類、倍半萜類、黃酮、甾體和有機酸等多種成分[2-3]。藥理研究表明：益智仁具有抗氧化與神經(jīng)保護[4]、強心[5]、鈣拮抗[6]、抗腫瘤[7]和抑制腫瘤血管形成[8]等活性。為了深入開發(fā)利用這一傳統(tǒng)中藥材資源、挖掘新的有效成分,作者對益智仁的化學成分進行了較為系統(tǒng)的分離和鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

供試益智仁于 2007年 12月購于安徽省亳州中藥材大市場,由安徽大學生命科學學院王開金教授鑒定。

主要儀器包括 XRC-1顯微熔點儀 (溫度未校正,四川大學科學儀器廠)、B rukerAM-400核磁共振儀(TM S為內(nèi)標,德國B ruker公司)和 VG AutoSpec-3000質(zhì)譜儀 (英國 VG公司)。

層析柱為 Sephadex LH-20(75～100μm,瑞典 Pharm acia Fine Chem icalCo.L td.)和MC IGEL CHP20P(75～150μm,日本M itsubishiChem icalCo.)；硅膠(200～300目)和硅膠板 H購自青島海洋化工廠；所用試劑均為重蒸工業(yè)級或分析純。采用 10％硫酸 -乙醇溶液加熱顯色。

1.2 提取與分離

取干燥益智仁 4 kg,粉碎后過 20目篩,用 20 L體積分數(shù)80％乙醇回流提取 3次,每次 3 h,合并提取液,減壓濃縮得浸膏約 280 g；將浸膏懸浮于水中,經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取,每種溶劑分別萃取 4次,分別合并、濃縮后,得石油醚部分浸膏 60 g、乙酸乙酯部分浸膏 100 g、正丁醇部分浸膏50 g及水相部分浸膏約 65 g。

將乙酸乙酯部分上硅膠柱,用石油醚 -丙酮混合液梯度洗脫(體積比 20∶1～0∶1),得到A～G 7個流分。B流分經(jīng)硅膠柱層析,用石油醚 -乙酸乙酯混合液梯度洗脫 (體積比 20∶1～5∶1),得到B1～B4 4個組分；B1組分先經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚 -乙酸乙酯混合液 (體積比 20∶1)洗脫,再經(jīng) Sephadex LH-20柱層析,用無水乙醇反復洗脫,得到化合物Ⅰ(20mg)；B2組分先經(jīng) Sephadex LH-20柱層析,無水乙醇洗脫,再經(jīng)甲醇 -石油醚混合液 (體積比 4∶1)萃取,濃縮后得到化合物Ⅱ(13 mg)；B 3部分先經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚 -乙酸乙酯混合液(體積比10∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20柱層析,無水乙醇洗脫,得到化合物Ⅲ(25m g)。C流分先經(jīng)硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯混合液(體積比 3.5∶1)洗脫,再通過MC I柱層析,用水 -甲醇混合液梯度洗脫(體積比 1∶0～0∶1),得到化合物Ⅳ(10mg)。F流分先經(jīng)硅膠柱層析,三氯甲烷 -甲醇混合液梯度洗脫(體積比 10∶1～8∶1),再經(jīng) Sephadex LH-20柱層析,無水乙醇洗脫,得到化合物Ⅴ(20m g)。G流分經(jīng)硅膠柱層析,三氯甲烷 -甲醇混合液(體積比 8∶3)洗脫,得到白色固體,用無水甲醇反復洗滌后,得到化合物Ⅵ(17m g)。

石油醚部分上硅膠柱,用石油醚 -丙酮混合液梯度洗脫(體積比 40∶1～10∶1),得到A～E 5個流分。A流分先經(jīng)硅膠柱層析,用石油醚 -乙酸乙酯混合液(體積比 50∶1)洗脫,得到白色粉末,再依次用無水甲醇和無水乙醇分別洗滌 3次,得到化合物Ⅶ(14m g)。D流分先經(jīng)硅膠柱層析,石油醚 -乙酸乙酯混合液(體積比 30∶1)洗脫,得到白色蠟狀固體,用無水甲醇反復洗滌,得到化合物Ⅷ(13m g)。E流分經(jīng) Sephadex LH-20柱層析,用無水乙醇反復洗脫,得到白色片狀晶體Ⅸ(25m g)。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)化合物的理化性質(zhì),采用M S和NMR等技術(shù),并結(jié)合已知文獻數(shù)據(jù),對分離得到的化合物Ⅰ～Ⅸ進行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié) 果

化合物Ⅰ：黃色油狀物；EI-M S(m/z)：312[M]+；結(jié)合NMR數(shù)據(jù)確定其分子式為 C20H24O3。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ：2.75～2.78(2H,m,H-1),2.55(2H,m,H-2), 2.39(2H,m,H-4),1.52～1.55(4H,m,H-5,6),2.66～2. 70(2H,m,H-7),6.75(1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.61(1H, dd,J=1.8,8.0 Hz,H-5′),6.73(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′), 7.12～7.26(5H,m,H-2″～H-6″),3.78(3H,s,-OCH3)。13C -NMR(100MHz,CD3OD)δ：30.5(C-1),45.3(C-2),213.2(C-3),43.5(C-4),24.3(C-5),32.0(C-6),36.6(C-7),134.0(C-1′),113.1(C-2′),148.8(C-3′),145.7(C-4′),116.1(C-5′),121.7(C-6′),143.5(C-1″),129.4(C -2″,6″),129.3(C-3″,5″),126.7(d,C-4″),56.4(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[9-10]報道的益智酮甲的數(shù)據(jù)一致,故確定該化合物為益智酮甲(yakuchinone A)。

化合物Ⅱ：黃色油狀物；EI-M S(m/z)：310[M]+；結(jié)合NMR數(shù)據(jù)確定其分子式為 C20H22O3。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ：7.54(1H,d,J=16.0 Hz,H-1),6.65(1H,d,J=16.0 Hz,H-2),1.64～1.67(4H,m,H-5,H-6),2.61～ 2.70(4H,m,H-4,7),7.11(1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),7.09(1H,dd,J=1.6,8.0 Hz,H-5′),6.81(1H,d,J=8.0 Hz,H -6′),7.16～7.24(5H,m,H-2″～H-6″)。13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：143.5(C-1),124.6(C-2),203.4(C-3),41.1(C-4),25.3(C-5),32.2(C-6),36.6(C-7), 127.7(C-1′),111.9(C-2′),149.4(C-3′),151.0(C-4′), 116.6(C-5′),124.1(C-6′),145.3(C-1″),129.3(C-2″, 6″),129.4(C-3″,5″),126.7(C-4″),56.4(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[9-10]報道的益智酮乙的數(shù)據(jù)一致,故確定該化合物為益智酮乙(yakuchinone B)。

化合物Ⅲ：黃色無定形粉末；EI-MSm/z(％)：268[M]+(100),239(47),225(24),166(7),138(15),123(6),120(10), 110(7),108(5),105(7),102(6),95(4),77(7),69(9)；結(jié)合NMR數(shù)據(jù)確定其分子式為 C16H12O4。1H-NMR(400 MHz, acetone-d6)δ：6.83(1H,s,H-3),6.36(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.74(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),7.58～8.10(5H,m,H-2′～H-6′),3.95(3H,s,-OCH3)。13C-NMR(100MHz,acetoned6)δ：165.9(C-2),107.3(C-3),184.3(C-4),164.1(C-5),99.9(C-6),167.8(C-7),94.4(C-8),159.8(C-9),107. 2(C-10),133.2(C-1′),128.3(C-2′,6′),131.0(C-3′,5′), 133.8(C-4′),57.5(7-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[11]報道的楊芽黃素的數(shù)據(jù)一致,故確定該化合物為楊芽黃素(tectochrysin)。

化合物Ⅳ：褐色油狀物；ESI-MS(m/z)：145[M+H]+；結(jié)合NMR數(shù)據(jù)確定其分子式為C9H10O。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ：6.63(1H,d,J=2.0 Hz,H-3),6.57(1H,dd,J= 8.0,2.0 Hz,H-5),6.73(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),2.48(2H, t,J=7.6 Hz,H-7),2.76(2H,t,J=7.6 Hz,H-8),3.76(1H,s,-OCH3)。13C-NMR(100MHz,CD3OD)δ：134.2(C-1),146.0(C-2),116.4(C-3),149.1(C-4),113.3(C-5), 121.9(C-6),32.2(C-7),38.0(C-8),56.6(4-OCH3)。此化合物被鑒定為 4-methoxy-1,2-dihydrocyclobutabenzene,為 1種新的天然產(chǎn)物,Tan等[12]已報道了其化學合成方法。

化合物Ⅴ：褐色粉末；ESI-M S(m/z)：155[M+H]+；結(jié)合NMR數(shù)據(jù)確定其分子式為 C7H6O4。1H-NMR(400 MHz, CD3OD)δ：7.43(1H,dd,J=7.9,2.0 Hz,H-6),7.41(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.78(1H,d,J=7.9 Hz,H-5)。13C-NMR (100MHz,CD3OD)δ：123.1(C-1),117.7(C-2),145.9(C-3),151.4(C-4),115.7(C-5),123.9(C-6),170.3(COO-)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[13]報道的原兒茶酸的數(shù)據(jù)一致,故確定該化合物為原兒茶酸(p rotocatechuic acid)。

化合物Ⅵ：白色粉末；L ieberm ann-Burchard反應(yīng)呈陽性, M o lish反應(yīng)也呈陽性；與標準品β-胡蘿卜苷共同薄層層析,分別在石油醚 -丙酮 (體積比3∶1)、石油醚 -乙酸乙酯 (體積比4∶1)和三氯甲烷 -甲醇 (體積比 10∶1)3種溶劑系統(tǒng)下展開, Rf值相同,斑點不分離,混合熔點不下降。故確定該化合物為β-胡蘿卜苷 (β-daucostero l)。

化合物Ⅶ：白色固體粉末；EI-M S(m/z)：396[M+-CH3(CH2)14COOH]；結(jié)合NMR數(shù)據(jù),確定該化合物分子式為 C45H80O2。1H-NMR(400MHz,CDC l3)δ：4.60(1H,m,H-6),5.26(1H,d,J=4.8 Hz,H-6),0.68(3H,s,H-18),1.02 (3H,s,H-19),0.93(3H,d,J=6.8 Hz,H-21),0.86(3H,d,J=7.0 Hz,H-26),0.81(3H,d,J=6.6 Hz,H-27),0.89 (3H,t,J=7.2 Hz,H-29),2.30(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),1. 25[28H,m,(CH2)14],1.61(2H,m,H-15′),0.88(3H,t,J= 6.8 Hz,H-16′)。13C-NMR(100MHz,CDC l3)δ：37.0(C-1),27.2(C-2),73.7(C-3),38.2(C-4),139.7(C-5), 122.6(d,C-6),31.9(C-7),29.7(C-8),50.0(C-9),36.6(C-10),21.0(C-11),38.1(C-12),42.3(C-13),56.7(C -14),24.3(C-15),28.2(C-16),56.0(C-17),11.8(C-18),19.3(C-19),36.2(C-20),18.8(C-21),33.9(C-22),26.1(C-23),45.8(C-24),29.1(C-25),19.8(C-26),23.1(C-27),19.0(C-28),12.0(C-29),174.3(C-1′),34.7(C-2′),25.0(C-3′),29.1～29.7(C-4′～13′), 31.9(C-14′),22.7(C-15′),14.1(C-16′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的谷甾醇棕櫚酸脂的數(shù)據(jù)一致,故確定該化合物為谷甾醇棕櫚酸脂(sitosterylpalm itate)。

化合物Ⅷ：白色蠟狀固體；mp：63℃～64℃；E IM S（m/z)：256[M]+；結(jié)合NMR數(shù)據(jù)確定該化合物分子式為 C16H32O2。1H-NMR(400MHz, CDC l3)δ：2.35(2H,t,J=7.2 Hz,H-2),1.18～1.30[28H,m, (CH2)14],1.64(2H,m,H-15),0.88(3H,t,J=6.8 Hz,H-16)。13C-NMR(100MHz,CDC l3)δ：178.9(C-1),33.9(C-2),27.4(C-3),29.1～29.7(C-4～13),31.9(C-14),22.7(C-15),14.1(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的棕櫚酸的數(shù)據(jù)一致,故確定該化合物為棕櫚酸(palm itic acid)。

化合物Ⅸ：白色片狀晶體(三氯甲烷)；mp：165℃～166℃；L ieberm ann-Bu rchard反應(yīng)呈陽性；與豆甾醇標準品共同薄層層析,分別在石油醚 -丙酮 (體積比 4∶1)、石油醚 -乙酸乙酯 (體積比 5.5∶1)和三氯甲烷 -甲醇 (體積比 15∶1)3種溶劑系統(tǒng)下展開,R f值相同,只顯示 1個斑點,混合熔點不下降。故確定此化合物為豆甾醇 (stigm astero l)。

從益智仁的 80％乙醇提取物中分離鑒定了 9個單體成分,其中,從乙酸乙酯部分分離并鑒定出化合物Ⅰ～Ⅵ,從石油醚部分分離并鑒定出化合物Ⅶ～Ⅸ。9個化合物主要包括了二芳基庚烷類、黃酮、甾體、有機酸等成分,其中,化合物Ⅳ為1種新的天然產(chǎn)物,為罕見的苯并環(huán)丁烯類成分；化合物Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ則首次從益智仁中分離得到。本研究結(jié)果為益智仁這一傳統(tǒng)中藥材資源的深度開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)資料。

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