李洋，滿朝新，趙秋蓮，劉珊珊，劉穎，董鑫悅，姜毓君

（國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086)

乳及乳制品中動物水解蛋白L-羥脯氨酸的檢測技術(shù)

李洋，滿朝新，趙秋蓮，劉珊珊，劉穎，董鑫悅，姜毓君

（國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086)

介紹了檢測乳及乳制品中L-羥脯氨酸的常用方法，主要包括高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氨基酸自動分析儀測定法，毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法和分光光度法，并對今后乳及乳制品中動物水解蛋白檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢進(jìn)行了分析。

動物水解蛋白；L-羥脯氨酸；檢測；乳及乳制品

0 引言

乳中摻入動物水解蛋白是提高乳中蛋白質(zhì)含量的摻假手段之一。動物水解蛋白是由動物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質(zhì)，長期飲用會引發(fā)人體中毒，所以，國家禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。L-羥脯氨酸是動物水解蛋白中膠原的特征性氨基酸之一，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對穩(wěn)定[1]，而乳中是不含這種氨基酸的。因此，可以將L-羥脯氨酸的有無作為檢測乳及乳制品中是否摻入動物水解蛋白的標(biāo)示物[2]。

目前，針對L-羥脯氨酸的測定方法主要有高效液相色譜法[3]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-5]、氨基酸自動分析儀測定法[6]、毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法[7]、分光光度法[8]，本文對相關(guān)檢測技術(shù)進(jìn)行了綜述。

1 檢測技術(shù)

1.1 柱前衍生高效液相色譜法

高效液相色譜在分析實(shí)驗(yàn)室已越來越普及。柱前衍生是一種先將氨基酸轉(zhuǎn)化成衍生物，再進(jìn)行色譜分離的衍生方法，柱前衍生高效液相色譜法分析L-羥脯氨酸，常用的柱前衍生試劑是2,4-二硝基氟苯(DNFB)[9，10]，該衍生試劑衍生得到的衍生物穩(wěn)定性好，并且過量的DNFB對分析沒有影響。色譜柱通常采用C18柱，衍生條件為樣品與衍生劑渦旋混合10～15 s后室溫下放置1 min，然后在55℃烘箱內(nèi)加熱10 min。檢出限可達(dá)到2.5 mg/L[9]。該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的重現(xiàn)性，具有分析時間短，成本低，重現(xiàn)性好，適用樣品范圍廣等特點(diǎn)，可作為乳及其他乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法。

金蘇英[11]等采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定奶粉及其他乳制品中L-羥脯氨酸。樣品經(jīng)酸水解后，用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC試劑）衍生水解樣品中的L-羥脯氨酸，以磷酸鹽緩沖溶液、乙腈、水梯度洗脫，通過symmetry C18柱將L-羥脯氨酸與其他18種氨基酸分離，在248 nm波長下用紫外檢測器檢測。測定結(jié)果為，在濃度為0～2.05 mmol/L范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系（r= 0.9991），加樣回收率為95.1%～101%，方法精密度RSD（n=7）為1.3%。該方法具有簡單、穩(wěn)定、靈敏度高、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

唐志毅[12]等采用鄰苯二甲醛和芴甲基氯甲酸酯兩個衍生劑測定尿中的羥脯氨酸，以C8柱為色譜柱，無雜質(zhì)干擾，特異性好；研究者也有以異硫氰酸苯酯(PITC)為衍生試劑，測定了保健食品中游離和非游離的L-羥脯氨酸[13]。這兩種方法也可以在乳及乳制品中L-羥脯氨酸的檢測中加以應(yīng)用。

1.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS）的研究已經(jīng)有了約30年的發(fā)展歷史，并且在分析氨基酸方面得到了較多的應(yīng)用。質(zhì)譜具有靈敏、專屬、能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的特點(diǎn)，是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用將液相色譜與質(zhì)譜相結(jié)合的方法。隨著HPLC/MS的發(fā)展，其在化工、生物、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域中均得到了廣泛的應(yīng)用。

王一紅等[5]采用HPLC/MS法，用電噴霧ESI源,在正離子模式下建立了18種游離氨基酸的測定方法，通過選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）方式對18種氨基酸的母離子及子離子進(jìn)行監(jiān)測，并用三級四極質(zhì)譜測定。測得結(jié)果回收率為95%～104%，相關(guān)系數(shù)0.9931～0.9999，檢出限為0.5～8 mol/mL。

1.3 氨基酸自動分析儀測定法

氨基酸自動分析儀測定法是一種離子色譜柱后衍生法，經(jīng)過陽離子交換柱的分離作用，能使L-羥脯氨酸與其它氨基酸分離，L-羥脯氨酸再與茚三酮反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物，并在波長440 nm檢出。使用氨基酸自動分析儀來分析L-羥脯氨酸，在其標(biāo)準(zhǔn)分析條件下即可實(shí)現(xiàn)L-羥脯氨酸與其他氨基酸的完全分離，因而該方法更加準(zhǔn)確、快速，并且其靈敏度和自動化程度很高。利用氨基酸自動分析儀法測定乳及乳制品中L-羥脯氨酸，可以直接進(jìn)行對L-羥脯氨酸的分析，避免了氨基酸衍生產(chǎn)物的多樣性，也不用考慮樣品中氨基酸衍生不徹底等問題，該方法樣品處理簡便易操作，能快速、準(zhǔn)確地判斷乳及乳制品中是否添加了動物水解蛋白。并且，在測定L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度的同時，又可以同時測定出其他的16種水解氨基酸。

張秀堯[14]等人采用氨基酸自動分析儀法檢測乳及乳制品中L-羥脯氨酸，將樣品酸水解后，直接用氨基酸自動分析儀檢測。測定結(jié)果檢出限為0.3 mg/L，加標(biāo)回收率在96.8%～107%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%～4.9%。所以，氨基酸自動分析儀法適合于乳與乳制品中是否添加動物水解蛋白的鑒定，具有非常好的應(yīng)用前景。

曾暖茜[15]等人用氨基酸自動分析儀測定乳制品中L-羥脯氨酸，當(dāng)L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度在5～30 mg/L范圍內(nèi),L-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)測得樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，加標(biāo)回收率為94.9%～105%，平均回收率為98.4%。

1.4 毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法

毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法的原理是膠原蛋白堿水解生成氨基酸，經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)衍生，再通過LIF-CE分離后，測定膠原蛋白特異性氨基酸L-羥脯氨酸。毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測可大大提高測定的靈敏度，從而滿足生物樣品測定的要求。已有諸多報道采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法測定氨基酸，并取得滿意的分析結(jié)果[16]。而將該法用于測定L-羥脯氨酸，國內(nèi)外僅有少量報道[17]。

鄒曉莉[7]等采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法分離測肌腱中的L-羥脯氨酸。將膠原蛋白堿水解生成氨基酸，用異硫氰酸熒光素衍生，采用LIF-CE分離測定L-羥脯氨酸。測定結(jié)果為，在0.5～8×103μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.5 μg/L。相對遷移率和相對峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為5.0%和6.1%，加標(biāo)回收率為95%～110%。

1.5 分光光度計檢測法

相對而言，高效液相色譜法和液譜-質(zhì)譜聯(lián)用法所需要的儀器尚未普及，而且成本相對較高，所以這兩種方法在基層實(shí)驗(yàn)室和某些企業(yè)中會受到限制，因而需要建立一種實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單、操作簡便、對設(shè)備儀器要求較低的實(shí)驗(yàn)方法來檢測乳及乳制品中的L-羥脯氨酸，以便于推廣。

分光光度計法在肉與肉制品中L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度測定中比較常用，在1990年即被列入國家標(biāo)準(zhǔn)，并且一直沿用至今。由此發(fā)展而來的用于乳及乳制品檢測的L-羥脯氨酸-氯胺T法，其原理是動物水解蛋白水解出來的游離的L-羥脯氨酸可以被氯胺T氧化，生成吡咯類化合物，在一定的溫度下該化合物能與對二甲氨基苯甲醛生成一種紅色化合物[18]，在可見光波長下該紅色化合物有一定的吸收，故可通過分光光度計來測定其質(zhì)量濃度[19]。該方法樣品前處理簡單、分析速度較快、應(yīng)用范圍廣泛，其重復(fù)性和檢測限均可基本滿足要求。戴絢麗等[20]先用鹽酸水解奶粉，然后用氯胺T法測定了其水解后的L-羥脯氨酸。該方法的線性范圍為0.002～3 μg/L，回收率在90.06%～94.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%。

2 結(jié)果與展望

本文所介紹的高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氨基酸自動分析儀測定法、毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法以及分光光度計法測定乳及乳制品中的L-羥脯氨酸，各有優(yōu)點(diǎn)和不足。高效液相色譜法是目前實(shí)驗(yàn)室較為常見的分析檢測方法，該方法前處理簡單，具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，近年來在多個檢測領(lǐng)域得到了極為廣泛的應(yīng)用；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也是現(xiàn)階段的一個重要檢測方法，但由于其耗材貴、成本高使不少實(shí)驗(yàn)室望而止步，同時高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在定量方面與高效液相色譜法相比還有一定差距；分光光度計法在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室均可以進(jìn)行，該方法前處理和所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備更為簡單，可以快速的檢測乳制品中的L-羥脯氨酸，但在檢測靈敏度方面與高效液相法相比還有很大的不足，準(zhǔn)確性較差也使得該方法受到了一定的限制，適用于樣品的初篩。氨基酸自動分析儀測定法避免了氨基酸衍生產(chǎn)物的多樣性和氨基酸衍生不徹底等問題，樣品處理簡便易操作，快速、準(zhǔn)確，對于具備該儀器的實(shí)驗(yàn)室，此方法是一較好選擇。毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法一樣，由于儀器設(shè)備等因素，目前在國內(nèi)應(yīng)用還不多。

以L-羥脯氨酸為特征性指標(biāo)檢測乳及乳制品中的動物水解蛋白的常用方法。動物膠原蛋白的另一個特征水解產(chǎn)物是羥賴氨酸，但通過液相質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)羥賴氨酸在植物中也含有[21]，因此也難以作為特征性檢測指標(biāo)。今后能否將動物蛋白水解液中的脂肪酸、有機(jī)酸等作為動物蛋白水解特征產(chǎn)物，仍需進(jìn)一步研究。此外，現(xiàn)有檢測乳及乳制品中動物水解蛋白的方法都需要一定的儀器設(shè)備，難以滿足現(xiàn)場執(zhí)法等快速檢測的需要，因此更為快速有效的檢測手段（如檢測試紙條等）也將具有非常廣闊的前景。

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Detection of L-Hydroxyproline of Hydrolyzed animal protein in the milk and dairy products

LI Yang，MAN Chao-xin，ZHAO Qiu-lian,LIU Shan-shan，LIU Ying，DONG Xin-yue，JIANG Yu-jun
(National Dairy Engineering&Technical Research Center，Harbin 150086，China)

This paper reviews several methods to detect the L-hydroxyproline,including high performance liquid chromatography,high performance liquid chromatography mass spectrometry,automatic amino acid analyzer,capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detection,and spectrophotometry.In addition，the trends of related techniques to detect hydrolysis of animal protein in milk and dairy products were predicted.

Animal protein hydrolysate；L-hydroxyproline;detection;milk and dairy products

TS252.7

B

1001-2230（2011）05-0047-03

2011-01-20

國家科技支撐計劃（2009BADB9B06）。

李洋(1987-)，女，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>

姜毓君