L-丙氨酸對(duì)INS-1E細(xì)胞胰島素分泌功能的影響

劉振平 申 晶 宋曉艷

糖尿病患者胰島素（insulin,INS）相對(duì)或絕對(duì)缺乏，使升血糖激素和降血糖激素之間的平衡被打亂，導(dǎo)致糖原合成下降，糖異生增加，血糖升高；脂肪合成減少，脂肪分解增加，游離脂肪酸增加；蛋白質(zhì)合成減少，分解增加，氨基酸（amino acid,AA）代謝紊亂。L-丙氨酸是糖異生最主要的AA，也是肌肉蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生最多的AA之一。有動(dòng)物研究表明L-丙氨酸在胰島B細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用[1]。本文旨在探討L-丙氨酸對(duì)B細(xì)胞株INS-1E的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、牛血清白蛋白、N-2-羥乙哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES）、L-丙氨酸及RPMI1640均購(gòu)自Sigma公司；自行配制Krebs-Ringer緩沖液（主要成分115 mmol/L氯化鈉,4.7 mmol/L氯化鉀,1.28 mmol/L氯化鈣,5.0碳酸氫鈉,25 mmol/L HEPES，調(diào)至pH 7.4），INS-1E細(xì)胞由C.B.Wollheim教授（瑞士）饋贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) INS-1E細(xì)胞在37°C培養(yǎng)箱、5%CO2中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為改良的RPMI 1640（加有10%胎牛血清，11.1 mmol/L的葡萄糖，10 mmol/L的HEPES，100 IU/mL的青霉素，100 mg/L的鏈霉素，0.5%牛血清白蛋白），細(xì)胞在細(xì)頸瓶中貼壁生長(zhǎng)，每周傳代1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為研究L-丙氨酸刺激INS-1E細(xì)胞分泌INS的劑量依賴(lài)性，分別對(duì)16.7 mmol/L葡萄糖加0、0.1、0.25、1、5、10及20 mmol/L的L-丙氨酸；為研究L-丙氨酸刺激INS分泌的葡萄糖依賴(lài)性，配制1.1、3.3、6.7、11.1、16.7及25 mmol/L葡萄糖2份，一份為葡萄糖組，另一份各加入10 mmol/L L-丙氨酸的條件做對(duì)照比較（葡萄糖+AA組）。

1.4 INS-1E細(xì)胞釋放胰島素 應(yīng)用胰酶消化，培養(yǎng)液稀釋?zhuān)x心收集INS-1E細(xì)胞，種植在24孔板中，每孔1 mL，2.5×105個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱、5%CO2培養(yǎng)2 d，移出培養(yǎng)液，加入Krebs-Ringer緩沖液1 mL，37℃培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)30 min，移出緩沖液；每個(gè)孔中分別加入1.1、3.3、6.7、11.1、16.7及25 mmol/L葡萄糖或(和)10 mmol/L L-丙氨酸緩沖液。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，從每孔吸取300 μL上清液，1 000 r/min離心2 min，取200 μL上清液-20℃保存待測(cè)。移出每孔中剩余的反應(yīng)液，加入0.1 g/L氫氧化鈉1 mL放置30 min溶解細(xì)胞，充分混勻收集1 mL溶液，-20℃保存。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 各實(shí)驗(yàn)組均進(jìn)行INS和蛋白質(zhì)的測(cè)定。應(yīng)用大鼠INS（Novo Nordisk）作標(biāo)準(zhǔn)，單125I標(biāo)記的人INS(Novo Nordisk A/S)作示蹤劑，應(yīng)用豚鼠抗豬INS抗體(Novo Nordisk, Bagsvaerd,Denmark)進(jìn)行放射免疫測(cè)定胰島素，應(yīng)用乙醇分離自由的和結(jié)合的放射活性，批內(nèi)變異系數(shù)5%，批間變異系數(shù)10%。應(yīng)用Bio-Rad公司的蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)以校正INS的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 4.03軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，2組間資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E細(xì)胞分泌INS的劑量依賴(lài)性 隨著L-丙氨酸濃度的進(jìn)行性增加，INS分泌呈增加趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E細(xì)胞分泌INS的劑量依賴(lài)性 （±s）

表1 不同濃度L-丙氨酸+葡萄糖刺激INS-1E細(xì)胞分泌INS的劑量依賴(lài)性 （±s）

＊P＜0.05

組別(丙氨酸+葡萄糖) n 胰島素/蛋白質(zhì)（mg/g）0 mmol/L+16.7 mmol/L 0.1 mmol/L+16.7 mmol/L 0.25 mmol/L+16.7 mmol/L 1.0 mmol/L+16.7 mmol/L 5.0 mmol/L+16.7 mmol/L 10 mmol/L+16.7 mmol/L 20 mmol/L+16.7 mmol/L F 0.62±0.04 0.64±0.05 0.77±0.03 0.92±0.07 1.02±0.03 1.14±0.09 1.24±0.06 42.41＊12 12 12 12 12 12 12

2.2 丙氨酸刺激INS-1E細(xì)胞分泌胰島素的葡萄糖依賴(lài)性 與相應(yīng)的單純葡萄糖組的比較，除1.1、3.3 mmol/L差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＞0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中，葡萄糖組內(nèi)在1.1～25 mmol/L葡萄糖范圍內(nèi)，隨著葡萄糖濃度的增加，INS/蛋白質(zhì)呈增強(qiáng)趨勢(shì)；葡萄糖+AA組內(nèi)在1.1～11.1 mmol/L下，INS/蛋白質(zhì)亦呈增強(qiáng)趨勢(shì)，見(jiàn)表2。

表2 10 mmol/L L-丙氨酸聯(lián)合葡萄糖刺激INS-1E細(xì)胞分泌胰島素與相應(yīng)的單純葡萄糖組的比較［INS/蛋白質(zhì)(mg/g)，n=20，±s］

表2 10 mmol/L L-丙氨酸聯(lián)合葡萄糖刺激INS-1E細(xì)胞分泌胰島素與相應(yīng)的單純葡萄糖組的比較［INS/蛋白質(zhì)(mg/g)，n=20，±s］

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 葡萄糖濃度（mmol/L）1.1 3.3 6.7 11.1 16.7 25葡萄糖組葡萄糖+AA組t 0.22±0.01 0.23±0.02 0.456 0.27±0.02 0.30±0.02 1.147 0.76±0.03 1.07±0.05 5.200＊＊0.85±0.04 1.28±0.07 5.616＊＊0.86±0.03 1.18±0.05 5.012＊＊0.93±0.04 1.35±0.07 5.170＊＊

3 討論

糖尿病患者持續(xù)存在著糖、脂肪及蛋白質(zhì)的代謝紊亂。研究已經(jīng)證實(shí)高血糖和高血脂對(duì)B細(xì)胞的急慢性作用[2]，而目前高氨基酸血癥對(duì)B細(xì)胞的急慢性作用研究報(bào)道尚少。本研究結(jié)果顯示，在16.7 mmol/L葡萄糖存在的情況下，隨著L-丙氨酸濃度的逐漸增加，INS-1E細(xì)胞分泌INS的量逐漸增加，表明了L-丙氨酸對(duì)B細(xì)胞分泌INS的急性刺激作用。10 mmol/L L-丙氨酸在6.7～25 mmol/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞的INS分泌，并且隨著葡萄糖濃度的增加，INS分泌量也顯示了逐漸增加的趨勢(shì)。但在1.1、3.3 mmol/L葡萄糖存在的條件下，10 mmol/L L-丙氨酸未促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞的INS分泌，提示L-丙氨酸促進(jìn)INS分泌的作用依賴(lài)于一定水平葡萄糖的存在。

Brennan等[3]研究證實(shí)L-丙氨酸經(jīng)與鈉離子共同轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入B細(xì)胞，經(jīng)鈉離子內(nèi)流、胞漿膜去極化、電壓依賴(lài)的鈣通道開(kāi)放及鈣離子內(nèi)流，觸發(fā)INS胞吐作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，L-丙氨酸經(jīng)鈉離子共同轉(zhuǎn)運(yùn)誘發(fā)INS分泌僅占其促I(mǎi)NS分泌作用的10%～20%，而經(jīng)氧化磷酸化代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），使ATP/二磷酸腺苷（ADP）比值升高，致使ATP敏感的鉀通道關(guān)閉，胞漿膜去極化，電壓依賴(lài)的鈣通道開(kāi)放，鈣離子內(nèi)流，觸發(fā)INS胞吐作用；直接證據(jù)是呼吸鏈毒素寡霉素顯著地降低了L-丙氨酸刺激的克隆B細(xì)胞的INS分泌[3]。本研究結(jié)果亦顯示L-丙氨酸促進(jìn)INS分泌，并且證實(shí)其促I(mǎi)NS分泌作用依賴(lài)于一定的葡萄糖水平，考慮原因?yàn)楸彼岬臄z取依賴(lài)于葡萄糖氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP。正常人血漿中L-丙氨酸含量在0.5 mmol/L左右，本研究結(jié)果顯示在16.7 mmol/L葡萄糖存在的條件下，0.25 mmol/L L-丙氨酸誘導(dǎo)的INS釋放高于單純16.7 mmol/L葡萄糖，提示L-丙氨酸可能參與了糖尿病高血糖狀態(tài)下INS分泌的調(diào)節(jié)。

有研究認(rèn)為L(zhǎng)-丙氨酸促進(jìn)了B細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的代謝，L-丙氨酸與鈉離子共同轉(zhuǎn)運(yùn)致使胞漿內(nèi)Ca2+增加，Ca2+活化丙酮酸脫氫酶，則來(lái)源于葡萄糖的丙酮酸代謝增加[3]；而葡萄糖代謝產(chǎn)生的ATP也促進(jìn)L-丙氨酸的攝取和利用[1]。本研究結(jié)果顯示，10 mmol/L L-丙氨酸和1.1、3.3 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的INS分泌與單純1.1、3.3 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的INS分泌的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，10 mmol/L L-丙氨酸+3.3 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的INS分泌較10 mmol/L L-丙氨酸、1.1 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的INS分泌顯著增加，提示L-丙氨酸與葡萄糖之間可能有協(xié)同作用。有研究指出，B細(xì)胞線粒體內(nèi)谷氨酸濃度是葡萄糖誘導(dǎo)的INS胞吐分泌的遞質(zhì)[4]，并認(rèn)為L(zhǎng)-丙氨酸經(jīng)代謝為谷氨酸進(jìn)而促進(jìn)INS釋放[5]。但需要更進(jìn)一步研究以確認(rèn)L-丙氨酸在糖尿病高血糖環(huán)境下對(duì)胰島B細(xì)胞分泌INS的急慢性作用。

[1]Dixon G,Nolan J,McClenaghan N,et al.A comparative study of amino acid consumption by rat islet cells and the clonal beta-cell line BRIN-BD11-the functional significance of L-alanine[J].J Endocrino，2003，179（3）:447-454.

[2] Poitout V,Robertson RP.Glucolipotoxicity:fuel excess and be?ta-cell dysfunction[J].Endocr Rev,2008,29（3）:351-366.

[3]Brennan L,Shine A,Hewage C,et al.A nuclear magnetic reso?nance-based demonstration of substantial oxidative L-alanine me?tabolism and L-alnine-enhanced glucose metabolism in a clonal pancreatic b-cell line[J].Diabetes,2002,51（6）:1714-1721.

[4] Newsholme P,Brennan L,Bender K.Amino acid metabolism, b-cell function,and diabetes[J].Diabetes,2006,55（suppl 2）: s39-s47.

[5]Rubi B,Ishihara H,Hegardt FG,et al.GAD65-mediated glutamate decarboxylation reduces glucose-stimulated insulin secretion in pancreaticbetacells[J].JBiolChem,2001,276（379）:36391-36396.