李 劍 鄭莉莉 王建禎(通訊作者)

1)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 洛陽 471003 2)中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院神經(jīng)外科 北京 100039

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層,是顱內(nèi)發(fā)病率最高、最難治愈的惡性腫瘤,約占所有顱內(nèi)腫瘤的35%～61%[1]。由于大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,與周圍正常腦組織分界不清,單純手術(shù)無法完全切除,手術(shù)后輔助化療能明顯提高腦膠質(zhì)瘤的治療效果?；熜Чc腦膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的敏感性有非常密切的關(guān)系[2],本研究采用M TT法檢測化療藥物對膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)細胞的敏感性,并根據(jù)試驗結(jié)果初步篩選化療藥物、預(yù)測臨床化療效果,以期為每個膠質(zhì)瘤患者制定最有效的個體化化療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料 80例標(biāo)本均取自北京武警總醫(yī)院神經(jīng)腫瘤外科在2009-07～2010-10手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本,均由經(jīng)驗豐富的神經(jīng)外科主刀醫(yī)師取材,病理診斷由北京武警總醫(yī)院病理科依據(jù)WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類與分級標(biāo)準(2000)作出。其中膠質(zhì)瘤III級48例,膠質(zhì)瘤IV級32例;男51例,女29例;年齡16～72歲,平均39.5歲。

1.2 主要試劑和化療藥物

1.2.1 主要試劑:含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibico公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、MTT液(Sigma公司)、二甲基亞砜(西安化學(xué)試劑廠)、胰蛋白酶(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、注射用青霉素G鈉(哈爾濱制藥總廠)、鏈霉素(河北華北制藥有限公司)。

1.2.2 化療藥物:長春新堿(VCR)、順鉑(DDP)、尼莫司汀(ACNU)、替莫唑胺(TMZ)、替尼泊甙(VM-26)。其血漿峰濃度(PPC)分別為0.57μ g/mL、0.97μ g/mL、3.67μ g/mL、5.95μ g/mL、3.50μ g/mL,5種藥物均以血漿峰濃度(PPC)為基點用生理鹽水稀釋成5種不同的濃度(見表1),PPC按公式Log(PPC)=-0.788+(0.755×log(LD50))[3]計算。

表1 5種化療藥物的配制濃度(μ g/mL)

1.3 膠質(zhì)瘤細胞的分離培養(yǎng) 在手術(shù)過程中切除的新鮮腫瘤無菌標(biāo)本中挑選魚肉狀組織,用生理鹽水清洗,去掉血液、壞死及電凝過的組織,放入無血清的RPMI-1 640培養(yǎng)液中并立即送實驗室;在超凈臺中用眼科剪等器械進一步剔除壞死組織和血凝塊,用含有青霉素和鏈霉素的不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗腫瘤組織,直至培養(yǎng)液透明,用眼科剪將腫瘤標(biāo)本剪成糊狀,用吸管輕輕吹打混勻;然后把混勻的腫瘤組織移至離心管,加適量的胰蛋白酶,37℃水浴振蕩1 h,離心后棄除上清液;加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液,然后重懸,之后用細胞濾器過濾懸液;再次離心,棄除上清并加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸;將腫瘤細胞懸液接種于96孔板中,每孔180μ L,將其放入37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)待用。

1.4 M TT法檢測 上述96孔板中的腫瘤細胞懸液在37℃、5%CO2,飽和濕度的條件下培養(yǎng)24 h后每個孔中加入20 μ L不同濃度的各種抗腫瘤藥物,使最終體積為200 μ L,每個條件均設(shè)3個復(fù)孔,同時設(shè)對照組。在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)72 h,然后每個孔中加入M TT20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用快速翻板法棄去上清,每孔內(nèi)加入二甲基亞砜100μ L,充分振蕩,直至甲瓚結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀(選擇570 nm波長)檢測OD值。取3孔OD值平均數(shù)根據(jù)下列公式計算細胞生長抑制率:抑制率(IR)=(1-實驗組OD值/無藥組OD值)× 100%。抑制率(IR)在50%以上認為對該藥敏感,IR低于50%歸入耐藥。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。各種化療藥物敏感率差別的假設(shè)檢驗用χ2檢驗和校正χ2檢驗,檢驗標(biāo)準為P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤細胞原代培養(yǎng)中腫瘤細胞的生長狀況 80例惡性腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本進行原代培養(yǎng),其中培養(yǎng)失敗16例,細菌污染導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的有10例標(biāo)本,其余6例失敗原因不明確。培養(yǎng)成功的64例標(biāo)本中膠質(zhì)瘤Ⅲ級42例,Ⅳ級22例;男40例,女24例。腫瘤細胞剛接種時以圓形、三角形及多角形為主,以后梭形細胞逐漸增多,直至以梭形為主,細胞大小不一,形態(tài)多樣,可見不規(guī)則形細胞,細胞突起較小,向四周伸展,可見多核、巨核細胞;72 h后細胞的突起變得非常明顯,呈星形、放射狀或不規(guī)則形,細胞體積也較前明顯增大。

2.2 抗腫瘤藥物在血漿峰濃度(PPC)下對64例培養(yǎng)成功的標(biāo)本的抑制情況 見表2、3。以IR＞80%為高度敏感,其例數(shù)分別為:VCR 0例,DDP為10例,ACNU為14例,TMZ為11例,VM-26為16例;以IR＞50%為敏感,其敏感率從大到小依次為:VM-26＞ACNU＞TMZ＞DDP＞VCR;經(jīng)χ2檢驗各種化療藥物敏感性之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 46.1,P＜0.05)。

表2 各種化療藥物敏感例數(shù)比較

表3 64例標(biāo)本對各種化療藥物敏感率比較 [例(%)]

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,化療在腦膠質(zhì)瘤的綜合治療中的作用越來越受到重視,盡管化療的手段越來越先進,通過藥物打開血腦屏障、動脈內(nèi)化療以及瘤腔內(nèi)化療均可使化療藥物有效通過血腦屏障,但耐藥問題一直無法取得較好的解決,腦膠質(zhì)瘤的臨床療效始終沒有突破性的進展。膠質(zhì)瘤細胞的原代培養(yǎng)+藥敏試驗?zāi)茉诨熐傲私饽z質(zhì)瘤細胞對于不同化療藥物的敏感性,可以為每個患者制定個體化的化療方案,避免無效化療,減少不必要的不良反應(yīng),提高化療效果[4-5]。

腫瘤細胞的原代培養(yǎng)是通過手術(shù)等方法直接從患者的腫瘤組織中取得標(biāo)本,然后按步驟進行的培養(yǎng)。所取的腫瘤標(biāo)本包含了腫瘤細胞的各種信號,這樣培養(yǎng)出來的腫瘤細胞與在體腫瘤細胞的真實狀態(tài)幾乎完全一致,所以在此基礎(chǔ)上進行的化療藥物敏感試驗符合膠質(zhì)瘤臨床化療的實際情況,可以很好的指導(dǎo)臨床化療。在膠質(zhì)瘤細胞原代培養(yǎng)時可以詳細觀察其生長特性,腫瘤惡性程度越高,細胞生長速度也越快,這與在體腫瘤的生長特性相同。因此,在培養(yǎng)過程中腫瘤細胞的生長活力可作為腫瘤惡性程度的一個標(biāo)記,觀察其生長特性甚至有可能成為判斷腫瘤級別的新標(biāo)準[6]。

MTT法最早是由Mosmann[7]在1983年時首先報道的體外化療藥物敏感試驗方法,具有操作簡便、試驗快速、費用低、對實驗室條件要求不高、不使用同位素等諸多優(yōu)點,迅速成為國內(nèi)外學(xué)者進行體外化療藥物敏感試驗的最常用的方法,為推進腫瘤個體化化療奠定了基礎(chǔ)。這種方法在投入應(yīng)用后的30 a年時間里不斷得到改進和優(yōu)化,其測定結(jié)果與臨床實際化療的符合率也逐年得到提高,現(xiàn)今總體符合率已經(jīng)可以達到74%～90%[8]。M TT法能較好的反映各種化療藥物對膠質(zhì)瘤的敏感性,尤其是陰性結(jié)果與臨床實際化療的結(jié)果基本相符,這足以為醫(yī)生制定臨床個體化化療方案提供有用的參考,幫助醫(yī)生選擇有效的化療藥物,設(shè)計合理的化療方案,避免使用體外藥敏試驗中的耐藥藥物,從而避免無意義甚至有害的化療。

本研究選用了目前國內(nèi)外膠質(zhì)瘤臨床化療方案中最常用的5種化療藥物。藥敏試驗結(jié)果示:以抑制率(IR)＞50%為敏感標(biāo)準,五種藥物對惡性腦膠質(zhì)瘤的敏感率依次為VM-26＞ACNU＞TMZ＞DDP＞VCR,結(jié)果顯示惡性腦膠質(zhì)瘤對VM-26、ACNU、TMZ較敏感,對VCR敏感性最差。由于腦膠質(zhì)瘤組織類型繁多,生物學(xué)特性各不相同,導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤同一個體對不同化療藥物的敏感性和不同個體對同一種化療藥物的敏感性均不同。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了相同的現(xiàn)象,如對惡性腦膠質(zhì)瘤敏感率比較高的的化療藥物如VM-26、ACNU、TMZ,也存在對其很不敏感的個體;而對惡性腦膠質(zhì)瘤敏感率很低的化療藥物如VCR亦存在對其敏感性很高的個體。這一結(jié)果充分說明了在惡性腦膠質(zhì)瘤化療前做體外藥敏試驗,選擇對不同個體敏感的化療藥物進行個體化化療的必要性。

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