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      恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)

      2011-03-18 02:53:52郭嬌嬌潘紅艷楊虎廖鑫宮智勇李谷
      關(guān)鍵詞:恩諾藥代沙星

      郭嬌嬌,潘紅艷,楊虎,廖鑫,宮智勇,李谷

      (1.武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢430023;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,湖北荊州434000)

      恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)

      郭嬌嬌1,潘紅艷1,楊虎1,廖鑫1,宮智勇1,李谷2

      (1.武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢430023;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,湖北荊州434000)

      采用高效液相色譜法,研究在單次口灌給藥途徑下,恩諾沙星在雜交鱘(施氏鱘Acipenser schrenckii♂×達(dá)氏鰉Huso dauricus♀)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。對雜交鱘單次口灌給藥恩諾沙星10 mg/kg后,用3P97藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:恩諾沙星在雜交鱘血液、肌肉和肝臟中的藥物時(shí)量曲線關(guān)系符合一級吸收的二室開放模型;該藥在血液、肌肉和組織中的平均回收率分別為93.6%±1.14%、92.65%±1.5%、92.82%±1.39%,在雜交鱘不同組織中分布較廣,其在血液、肌肉和肝臟的表觀分布容積v/f分別為26.987、6.2298、2.1515 L/kg;恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)消除較慢,在血液、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別為290.139、114.9、901.835 h,總體清除率分別為0.2288、0.1047、0.02164 L/(kg·h)。鑒于恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)消除較慢,建議養(yǎng)成階段使用其它藥物。

      雜交鱘;恩諾沙星;藥代動(dòng)力學(xué)

      恩諾沙星(Enrofloxacin)又名乙基環(huán)丙沙星、乙基環(huán)丙氟哌酸,是人工合成的第三代喹諾酮類化合物(Quinolone)——氟喹諾酮類藥物(Ftuoroquinolones)的一種,是畜禽和水產(chǎn)專用抗菌藥物,對大多數(shù)革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌及某些支原體、衣原體、立克次氏體等均有效[1]。因其高效廣譜、耐藥菌少、抗菌力強(qiáng)、作用迅速且與其它抗菌藥無交叉耐藥性而被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中感染性疾病的防治[2]。該藥的作用機(jī)理是:藥物直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞核,抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶,對染色體造成不可逆的損壞,通過阻止細(xì)菌細(xì)胞的分裂,從細(xì)胞核深處破壞細(xì)菌的代謝和增殖,能迅速殺死細(xì)菌,殺菌效果穩(wěn)定[3]。

      藥物在生物體內(nèi)的代謝過程和消除規(guī)律是制定給藥方案和休藥期的理論基礎(chǔ),目前關(guān)于恩諾沙星作用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究較多,如鯉Cyprinus carpio[4]、舌齒鱸Dicentrarchuslabrax[5]、眼斑擬石首魚Sciaenops ocellatus[6]、歐洲鰻鱺Anguilla[7]、大黃魚Pseudosciaena crocea[8]、中國對蝦Penaeus chinensis[9]、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis[10]等,但尚未見關(guān)于雜交鱘體內(nèi)恩諾沙星藥代動(dòng)力學(xué)方面的報(bào)道。為此,本試驗(yàn)中作者建立了恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的檢測方法,同時(shí)研究了恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律,以期為檢測恩諾沙星在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的殘留及在養(yǎng)殖中的合理使用提供參考資料。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 試驗(yàn)魚 試驗(yàn)用雜交鱘(施氏鱘Acipenser schrenckii♂×達(dá)氏鰉Huso dauricus♀)購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所窯灣試驗(yàn)場,體質(zhì)量為(80±10)g。

      1.1.2 藥品與試劑 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99% (Sigma公司);體積分?jǐn)?shù)為50%的HCl、檸檬酸、乙酸銨、無水硫酸鈉、乙腈(HPLC)、正己烷和鹽酸均為分析純。酸化乙腈為φ(乙腈)∶φ(體積分?jǐn)?shù)為50%鹽酸)=2500∶20。將0.05 mol/L的檸檬酸與0.01 mol/L的醋酸銨混合,配制成檸檬酸-醋酸銨混合溶液,保存于冰箱(2~8℃)中[11]。

      1.1.3 儀器 試驗(yàn)儀器包括:Varian 920-LC高效液相色譜儀配有熒光檢測器;FA2104N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn));渦旋混合器XH-C(金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn));CQ250超聲波(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn));高速冷凍離心機(jī)2-16k(Sigma公司);FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠生產(chǎn));0.22 μm微孔濾膜。

      1.2 方法

      1.2.1 暫養(yǎng) 試驗(yàn)前將雜交鱘于室內(nèi)玻璃水族箱(120 cm×60 cm×80 cm)中暫養(yǎng)1周,投喂不含任何藥物的飼料。選擇健康個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)前24 h停止喂食。試驗(yàn)期間,持續(xù)曝氣并對水體進(jìn)行循環(huán)過濾,水溫為(20±1)℃。每日早晚投喂適量雜交鱘飼料,及時(shí)排除殘餌和糞便,保持水質(zhì)清潔。試驗(yàn)期間雜交鱘的成活率為100%。

      1.2.2 藥餌配制及給藥方法 恩諾沙星口灌藥液的配制:用生理鹽水將恩諾沙星配成濃度為2 mg/mL的溶液。將醫(yī)用靜脈注射導(dǎo)管分切成15 cm左右長度的短管,接于1 mL注射器端口。定量抽取恩諾沙星溶液,按10 mg/kg魚體重單次灌藥。灌喂時(shí)將軟管小心地插入魚胃部,注意插入的深度,防止將胃部捅破。

      1.2.3 樣品采集 給藥前先采一組空白樣,然后于喂藥后的0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72、96、120、240、360、480、720、960、1 200 h采集樣品。每次采集3條雜交鱘,用一次性注射器于尾靜脈采血,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的肝素鈉,以8 000 r/min離心5 min,分離血漿。采血后將魚處死,取肝臟、背部肌肉,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.4 樣品處理 從冰箱中取出血漿樣品,恢復(fù)至4℃,取1 mL血漿置于10 mL塑料離心管中,加入適量的無水硫酸鈉,再加入3 mL酸化乙腈,均質(zhì)提取1 min(以8 000 r/min離心5 min);取上清液置于10 mL的尖底玻璃管中,往殘?jiān)兄貜?fù)加入3 mL酸化乙腈,重復(fù)上述操作一次,合并上清液于尖底玻璃管中,然后置于氮吹儀上于60℃水浴中吹干;用1.0 mL流動(dòng)相溶解干燥物,在漩渦振蕩器上振蕩3 min,直至殘留物完全溶解。加入正己烷2 min,在漩渦振蕩器上振蕩5 min,靜置分層,棄上清液,重復(fù)加入2 min正己烷一次,重復(fù)上述操作。然后用0.22 μm微孔濾膜過濾后,用于高效液相色譜分析。各取肌肉和肝臟樣品1 g,處理方法同上。

      1.2.5 色譜條件[11]色譜柱C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);熒光檢測器激發(fā)波長為280 nm、發(fā)射波長為450 nm;流動(dòng)相為φ(檸檬酸-醋酸銨混合鹽溶液)∶φ(乙睛)=80∶20,柱溫為30℃,流速為1 mL/min,進(jìn)樣體積為20 μL。

      1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g,用流動(dòng)相溶解定容至100 mL容量瓶中,配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配成0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,過0.22 μm濾膜上機(jī)測定,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

      1.2.7 回收率的測定 取0.1、0.5、1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 mL,加入空白血漿0.5 mL,混勻,靜置2 h,按樣品處理方法進(jìn)行提取和測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算恩諾沙星的濃度,與原來標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度比較計(jì)算相對回收率。即用相同方法可測得肝臟和肌肉組織中的相對回收率。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      藥物動(dòng)力學(xué)模型擬合及相關(guān)參數(shù)計(jì)算采用3P97藥代動(dòng)力學(xué)程序軟件處理。

      2 結(jié)果

      2.1 液相色譜的檢測方法

      恩諾沙星濃度為0.005~10 μg/mL時(shí)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.9998,線性方程為y= 412.11x+1.8749。肌肉、血液和肝臟中的相對回收率均在90%以上,結(jié)果見表1。

      表1 血液及組織中恩諾沙星的相對回收率(ˉx±s,n=3)Tab.1 Relative recovery rate of Enrofloxacin in the sturgeon plasma and tissues%

      2.2 恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

      2.2.1 恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的藥物濃度與時(shí)間的關(guān)系 恩諾沙星在雜交鱘肌肉、血液和肝臟中的藥物濃度與時(shí)間的關(guān)系見圖1。從圖1可見,在吸收階段(1 h內(nèi)),血液、肌肉和肝臟對藥物的吸收迅速,而在消除階段比較緩慢,利用率不高。

      圖1 口灌恩諾沙星在肌肉、血液和肝臟中的藥時(shí)曲線Fig.1 The relationship between Enrofloxacin concentration and time in the muscle,plasma,and liver of the sturgeon administrated orally

      恩諾沙星在吸收階段藥物濃度波動(dòng)比較大,這可能與取樣不連續(xù)(采樣時(shí)間間隔長),且對樣品的處理不能迅速完成有關(guān)。同時(shí),在樣品檢測時(shí)發(fā)現(xiàn),魚體存在藥物代謝的個(gè)體差異。在數(shù)據(jù)處理過程中,本試驗(yàn)中采取多次測定取相近值的方法得出最后數(shù)據(jù)。從藥時(shí)曲線圖(圖1)可以看出,恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的代謝符合藥物代謝動(dòng)力學(xué)的普遍規(guī)律。

      在藥時(shí)曲線中出現(xiàn)多峰現(xiàn)象,這與一些研究結(jié)果相符[5,11-14],證明恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)的再吸收是存在的。

      2.2.2 恩諾沙星的藥物代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律 將恩諾沙星以10 mg/kg劑量灌喂給藥,單次給藥后,采集血液及組織處理,經(jīng)高效液相色譜檢測,再經(jīng)3P97藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件分析,采用簡單模式,以均數(shù)值計(jì)算并自動(dòng)擬合,采用Marquardt法對一、二、三房室分別以權(quán)重1、1/C、1/C/C三種情況進(jìn)行曲線擬合,根據(jù)WSS與AIC值來判斷最佳藥代動(dòng)力學(xué)模型,最后得出肌肉、血液和肝臟中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù),根據(jù)參數(shù)可推出藥物濃度與時(shí)間的關(guān)系方程(表2)。恩諾沙星在肌肉、血液和肝臟中的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

      表2 給藥后雜交鱘的血液和組織中藥物濃度與時(shí)間關(guān)系的方程Tab.2 The equation between Enrofloxacin concentration and time in the sturgeon plasma and tissue by single oral administration

      經(jīng)軟件處理之后,恩諾沙星在雜交鱘肌肉、血液和肝臟中的代謝均屬于一級吸收的二室開放模型。一般認(rèn)為,表觀分布容積v/f值越大,藥物穿入組織越多,分布越廣,血中的藥物濃度越低,反之,則相反。研究表明,當(dāng)v/f接近于(0.8~1.0)L/kg時(shí),藥物在體內(nèi)分布廣泛且分布均勻;而v/f大于1 L/kg時(shí),則表明藥物的組織濃度高于血漿濃度,藥物在體內(nèi)分布廣泛或者說明組織蛋白對藥物有高度的結(jié)合。本試驗(yàn)中v/f均大于1,說明恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)分布廣泛。

      本研究結(jié)果表明,恩諾沙星在各組織中吸收較迅速,由消除率及消除半衰期可知,恩諾沙星在組織中的代謝較為緩慢,這與實(shí)際檢測中20 d后恩諾沙星仍有少量殘留相符合。

      3 討論

      3.1 關(guān)于流動(dòng)相的選擇

      陳雪昌等[15]通過多次比較試驗(yàn),最終確定流動(dòng)相為φ(乙腈)∶φ(檸檬酸-醋酸銨混合鹽溶液)=20∶80時(shí),用三乙胺調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH為4.5,恩諾沙星和雜質(zhì)峰分離效果好,峰形也比較理想[10,15]。若用甲醇代替乙腈,在流速為1.0 mL/min時(shí),整個(gè)體系的壓力將超過15.2 MPa,對儀器使用有一定的影響。

      表3 給藥后雜交鱘肌肉、血液和肝臟中藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of Enrofloxacin in the sturgeon plasma and tissue by single oral administration

      3.2 關(guān)于休藥期

      休藥期是指食用動(dòng)物組織中的殘留低于組織中允許的最大殘留限量的時(shí)間。本研究結(jié)果表明,給藥后20 d時(shí),恩諾沙星在雜交鱘血液、肌肉和肝臟中的殘留量為0.0325、0.03、0.08 μg/mL。2001年中國農(nóng)業(yè)部制定的《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》[16]中規(guī)定,恩諾沙星和環(huán)丙沙星在水產(chǎn)動(dòng)物中的最大殘留限量為0.05 μg/g,因此建議臨床給藥(恩諾沙星的劑量為10 mg/kg)時(shí),經(jīng)口單次灌喂后的休藥期至少為20 d以上。

      3.3 恩諾沙星的抗菌活性與藥效學(xué)

      Bowser等[17]研究了用恩諾沙星和惡喹酸治療殺鮭氣單胞菌的效果,結(jié)果表明,用恩諾沙星治療魚類細(xì)菌感染疾病臨床效果較好。張雅斌等[4]研究了恩諾沙星在鯉體內(nèi)的藥效學(xué)及藥動(dòng)力學(xué),結(jié)果表明:該藥物對淡水養(yǎng)殖魚類常見的5種致病菌——蘇伯利產(chǎn)氣單胞菌Aerormonas sobria、點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種Aeronwnas punctata puctata、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、魚害黏球菌Myxococcus piscicola、腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌Aeromonas punctata f.intestinalis均具有較強(qiáng)的抗菌作用,最小抑菌濃度(MIC)分別為0.02、0.04、0.63、0.31、0.04 μg/mL,尤其是細(xì)菌出血性敗血病致病菌——蘇伯利產(chǎn)氣單胞菌對恩諾沙星具有高度的敏感性;體外藥效試驗(yàn)得知,每日以10 mg/kg劑量混飼口灌給藥,能有效的殺滅致病菌,提高感染魚的成活率。本研究結(jié)果和眾多研究結(jié)果均表明,恩諾沙星對常見的病原菌具有較好的抗菌效果。

      3.4 與其它藥動(dòng)學(xué)的比較

      李春雨等[18]研究了恩諾沙星在鯉體內(nèi)的藥動(dòng)力學(xué),結(jié)果表明口灌給藥后,鯉血漿、肝臟、腎臟和肌肉組織中的藥時(shí)曲線符合一級消除二室模型。灌服給藥的血漿動(dòng)力學(xué)參數(shù):AUC為600.2961 μg/(h·mL)、Ka為0.1693 h-1、t1/2β為168.2871 h、Tp為3.6655 h、Cmax為3.2661 μg/mL。簡紀(jì)常等[6]研究了恩諾沙星在眼斑擬石首魚體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué),結(jié)果表明灌服組血漿的藥時(shí)數(shù)據(jù)符合一級吸收一室模型,動(dòng)力學(xué)方程為C=61482 (e-71092t-e-101356t),其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù):AUC為15.805 mg/(L·h)、Cmax為2.770 mg/L、Tmax為1.500 h、t1/2α為4.989 h、v/f為2.072 L/kg、Ka為7.092 h-1。與之相比,恩諾沙星在雜交鱘血漿中的達(dá)峰時(shí)間Tp為2.01 h,達(dá)峰濃度Cmax為0.3275 μg/mL,AUC為43.71 mg/(L·h)。上述研究表明,恩諾沙星在不同種屬魚體間存在一定的差異,特別是達(dá)峰濃度差異較大,這可能與給藥濃度、給藥方式、溫度等有關(guān),但恩諾沙星在大多數(shù)魚體內(nèi)的吸收程度較好。

      致謝:本試驗(yàn)在武漢工業(yè)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的協(xié)助下完成,在此表示感謝!

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      Pharmacokinetics of enrofloxacin in sturgeon Acipenser schrenckii

      GUO Jiao-jiao1,PAN Hong-yan1,YANG Hu1,LIAO Xin1,GONG Zhi-yong1,LI Gu2
      (1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Yangtze River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Jingzhou 434000,China)

      The pharmacokinetics of enrofloxacin in the sturgeon Acipenser schrenckii administrated by oral gavage at a dos of 10 mg/kg was investigated using the HPLC and by pharmacokinetics software 3P97.The concentrations versus time in plasma,muscle and liver in the sturgeon were well described by a two-department open model with first-order absorption,with the average enrofloxacin recovery of 93.6%±1.14%in plasma,92.65%±1.5%in muscle,and 92.82%±1.39%in liver.The enrofloxacin in the sturgeon had the ability to be widely distributed to diverse tissues.The apparent volume of distribution was found to be 26.987 L/kg in the plasma,6.2298 L/kg in the muscle and 2.1515 L/kg in the liver.The enrofloxacin elimination was found slowly,the elimination half-life (T1/2β)of 290.139 h in the plasma,114.9 h in the muscle and 901.835 h in the liver,and the total body clearance(CL/f(s))of 0.2288 L/(kg·h)in the plasma,0.1047 L/(kg·h)in the muscle and 0.02164 L/(kg·h)in the liver.So we suggest that other antibacterial drugs be used to prevent and treat bacterial diseases in the process of sturgeon growth on.

      Acipenser schrenckii;enrofloxacin;pharmacokinetics

      S965

      A

      2095-1388(2011)04-0362-05

      2010-10-13

      國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD37B05,2009BADB9B02);武漢工業(yè)學(xué)院校研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(09CX014)

      郭嬌嬌(1985-),女,碩士研究生。E-mail:guojiaojiao3344@126.com

      宮智勇(1966-),男,副教授,博士。E-mail:zhiyong-gong@yahoo.com.cn

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